Embriogênese somática e regeneração de plantas de dendezeiro (Elaeis guineensis Jacq.) a partir do uso de meios de consistência líquida e de cultivos em suspensão

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2013.O presente trabalho objetivou avaliar aspectos morfo-fisiológicos envolvidos na embriogênese somática e regeneração de plantas de dendezeiro (Elaeis guineensis Jacq.) a partir do uso de meios de consistência líquida e de cultivos em suspensão. Embriões zigóticos obtidos das variedades C 2501, C 2528 e C 7201 foram induzidos em meio de MS com 450 μM de Picloram, 30 g.L-1 de sacarose, 0,5 g.L-1 de glutamina, 2,5 g.L-1 de carvão ativado e 2,5 g.L-1 de Phytagel, sendo subcultivados ou não a cada 30 dias. Foi avaliado o efeito da passagem de calos embriogênicos por meios de cultura líquido e o estabelecimento de cultivos em suspensão sobre o processo de embriogênese somática e regeneração de plantas, porções embriogênicas foram transferidas para dois meios liquido: MeA (MS com 5 μM de Picloram) e MeB (MS com 5 μM de 2,4-D). Nessa fase foi possível separar dois tipos de propágulos: aqueles que não desagregaram completamente e aqueles considerados estabelecidos em suspensão. Num primeiro experimento, porções embriogênicas não desagregadas em meio líquido sob agitação (calos embriogênicos) foram transferidas para três meios de diferenciação: M1: ½ MS; M2: MS com 40 μM de Picloram e; M3: MS com 12,3 μM de 2iP e 0,6 μM de ANA. A partir dos embriões somáticos diferenciados, a regeneração de plantas foi realizada em meio de MS desprovido de reguladores de crescimento. Posteriormente, as plantas foram individualizadas e transferidas para meio de MS dupla-fase com 57 μM de AIB para induzir a formação de raízes, antes de serem aclimatizadas e transferidas para casa de vegetação. As plantas foram analisadas por citometria de fluxo para verificar possíveis alterações no conteúdo genômico. Os resultados revelaram que a condição de subcultivar a cada 30 dias foi determinante para estimular a formação de calos embriogênicos (20,8%). Verificou-se que a passagem de calos embriogênicos por meio líquido na presença de 2,4-D (MeB) proporcionou aumentos significativos na percentagem de calos com embriões somáticos diferenciados. Entre os meios testados, o M1 foi o que proporcionou os melhores resultados, com até 58,2% dos calos com embriões somáticos diferenciados. A variedade C 2528 no meio M3 apresentou os maiores índices de calos com embriões somáticos (80,2%), embora tenha sido no meio M1 que essa variedade apresentou o maior número de embriões tipo torpedo por calo (8,3). Embriões somáticos oriundos dos meios M1 e M3 também foram os que apresentaram as maiores frequências de regeneração, com 29,5% e 31,7% respectivamente. Na fase de aclimatização a percentagem de sobrevivência das mudas foi de 95,2%, ao final de 90 dias. Nas plantas regeneradas, a citometria de fluxo não evidenciou diferenças significativas no conteúdo médio de DNA nuclear quando comparadas com as plantas controle, tendo sido observado valores na ordem de 2C = 3,89±0,16 pg. Num segundo experimento, calos embriogênicos da variedade C 2528, estabelecidos e multiplicados em meio líquido MeB por um período de 210 dias, sob forma de agregados celulares, foram utilizados para diferenciação de embriões somáticos. Para tanto, os agregados foram transferidos para meio líquido de MS com 0,1 mg.L-1 de 2,4-D onde permaneceram por 0, 30 e 60 dias. Após os respectivos tempos, os agregados foram plaqueados em meio semissólido com a mesma constituição do meio anterior e acondicionados na ausência e presença de luz por até 90 dias. Para avaliar a influência do tamanho dos agregados na formação de embriões somáticos e regeneração de plantas durante o plaqueamento, os agregados foram divididos em duas classes: classe 1 e classe 2 (2 mm e 4 mm, respectivamente). Após 120 dias em meio semissólido, embriões somáticos foram transferidos para meio de MS para regeneração de plantas. Neste experimento, análises anatômicas foram realizadas para caracterizar e descrever as etapas envolvidas na diferenciação dos agregados celulares. Verificou-se que acima de 90% de ambas as classes de propágulos produzidos progrediram após serem plaqueados em meio semissólido. Quanto a taxa de embriões somáticos diferenciados, não foram observadas diferenças significativas entre as classes 1 e classe 2 de agregados (18,8% e 13,1%, respectivamente). No entanto, quando se avaliou agregados da classe 1, após 30 dias de diferenciação em meio sob suspensão, verificou-se que até 33,3% dos explantes apresentaram diferenciação de embriões somáticos, com a maior quantidade de embriões somáticos no estádio torpedo (8,3 por explante). ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe aim of this study is to evaluate morpho-physiological aspects involved in somatic embryogenesis and plant regeneration of the African oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) based on the use of liquid consistency media and cultures in suspension. Zygotic embryos of the varieties C 2501, C 2528 and C 7201 were induced in an MS medium with 450 μM Picloram, 30 g.L-1 sucrose, 0.5 g.L-1 glutamine, 2.5 g.L-1 activated charcoal and 2.5 g.L-1 Phytagel, being subcultured (or not) every 30 days. The effect of the passage of embryogenic calluses through a liquid culture media and the establishment of cultures in suspension on the processes of somatic embryogenesis and plant regeneration was evaluated. The embryogenic portions were transferred to two liquid media: MeA (MS with 5 μM Picloram) and MeB (MS with 5 μ2,4-D). In this stage it was possible to separate two types of propagules: those that did not completely disaggregate and those considered as established in suspension. In the first experiment, embryogenic portions that were not disaggregated in a liquid medium under agitation (embryogenic callus) were transferred to three differentiation media: M1 - ½ MS; M2 - MS with 40 μM Picloram and; M3 - MS with 12.3 μM 2iP and 0.6 μM NAA. Based on the differentiated somatic embryos, plant regeneration was performed in an MS medium devoid of growth regulators. Subsequently, the plants were individualized and transferred to a double-phase MS medium with 57 μM IBA to induce rooting, before being acclimatized and transferred to greenhouse. The plants were analyzed by flow cytometry to verify changes in genomic content. The results showed that the condition of subculturing every 30 days was a determining factor to stimulate the formation of embryogenic callus (20.8%). It was found that the passage of embryogenic calluses through a liquid medium in the presence of 2,4-D (MeB) provided significant increases in the percentage of calluses with differentiated somatic embryos. Among the media tested, M1 was the one that provided the best results, with up to 58.2% of the calluses with differentiated somatic embryos. The C 2528 variety in M3 medium showed the highest rates of calluses with somatic embryos (80.2%), although it was in the M1 medium that this variety exhibited the highest number of embryos per torpedo-shaped callus (8.3). Somatic embryos originating from M1 and M3 media were also the ones that showed the highest frequency of regeneration, with 29.5% and 31.7% respectively. During the acclimatization phase, the seedling survival percentage was 95.2% at the end of 90 days. In regenerated plants, flow cytometry showed no significant differences in the average nuclear DNA content when compared with control plants; values in the range of 2C = 3.89±0.16 pg were observed. In the second experiment, calluses of the C 2528 variety, established and multiplied in MeB liquid medium for a period of 210 days, in the form of cell aggregates, were used for the differentiation of somatic embryos. For both, the aggregates were transferred to liquid MS medium with 0.1 mg.L-1 2,4-D, where they remained for 0, 30 and 60 days. After the respective periods, the aggregates were plated in a semi-solid medium with the same constitution as the previous medium and placed in the absence and presence of light for up to 90 days. To assess the influence of the size of the aggregates on the formation of somatic embryos and regeneration of plants during plating, the aggregates were divided into two classes: Class 1 and Class 2 (2 mm and 4 mm, respectively). After 120 days in a semi-solid medium, the somatic embryos were transferred to an MS medium for plant regeneration. In this experiment, anatomical analyses were performed to characterize and describe the steps involved in the differentiation of the cell aggregates. It was found that over 90% of both classes of propagules produced progressed after being plated in a semi-solid medium. Regarding the rate of differentiated somatic embryos, no significant differences were observed between class 1 and class 2 of aggregates (18.8% and 13.1%, respectively). However, when the class 1 aggregates were evaluated, after 30 days of differentiation in a medium under suspension, it was found that 33.3% of the explants displayed differentiation of somatic embryos, with the highest number of embryos in the torpedo stage (8.3 per explant)