RNA de interferência como estratégia para controle de begomoviroses

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.Os begomovírus (Família Geminiviridae) compreendem um importante grupo de patógenos de plantas, capazes de infectar um grande número de culturas e causar impacto na agricultura. Esses agentes possuem um genoma constituído por uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, e são transmitidos de maneira persistente e circulativa pela mosca branca (Bemisia tabaci). No Brasil, esses vírus são altamente incidentes e causam grandes danos às culturas do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e do tomateiro (Solanum lycopersicum). O objetivo desse trabalho foi utilizar a estratégia de RNA de interferência (RNAi) como forma de controle genético de begomoviroses associadas a essas duas culturas. Inicialmente, no caso do feijoeiro, o mecanismo de RNAi foi utilizado para gerar uma linhagem de feijão imune ao bean golden mosaic virus (BGMV). Nós avaliamos se moscas brancas virulíferas, infectadas pelo BGMV, poderiam diminuir sua carga de DNA viral, após se alimentarem em plantas de feijão geneticamente modificadas (GM), que expressam moléculas de pequenos RNAs interferentes (siRNAs), que tem como alvo o gene rep desse vírus. Esse estudo demonstrou que a quantidade de DNA viral foi significativamente reduzida em moscas brancas que se alimentaram em plantas de feijão GM (comparado a moscas que se alimentaram em plantas não- GM), em 52% e 84%, nos períodos de 4 e 8 dias respectivamente. A segunda parte desse trabalho teve como objetivo, avaliar o mecanismo de RNAi como ferramenta na obtenção de plantas de Nicotiana benthamiana transgênicas, com resistência ampla a begomovírus que infectam tomateiro no Brasil. Para isso, um cassete de interferência quimérico - que expressa um haipin RNA (hpRNA) correspondendo ao gene rep de distintas espécies de begomovírus - foi desenvolvido. Os resultados demonstraram que um maior número de plantas transgênicas permaneceram não infectadas, após terem sido desafiadas com uma menor pressão de inóculo do vírus tomato golden vein virus (TGVV) (≈ 250 ng/μL de DNA viral/planta). As plantas transgênicas também foram inoculamos com os vírus tomato rugose mosaic virus (ToRMV), tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) e tomato interveinal chlorosis virus xiii! ! !!!!!!!!! (ToICV), e foi demonstrado que o fenótipo de resistência a esses agentes possivelmente é dependente da zigose do transgene. Uma proporção de 77% das plantas transgênicas, que apresentaram o fenótipo de resistência, demonstraram ser homozigotas.The begomovirus (Geminiviridae family) are an important group of plant pathogens that cause infection in a large number of crops and impact on agriculture. These agents have one or two molecules of single strand DNA, and are transmitted in a persistent and circulative manner by whitefly (Bemisia tabaci). In Brazil, these viruses have a high incidence and cause great damage to bean (Phaseolus vulgaris) and tomato (Solanum lycopersicum). The aim of this study was to use the molecular tool of RNA interference (RNAi) as a strategy of genetic control of begomovirus associated with these two crops. Initially, with respect to beans, the RNAi mechanism was used to generate a plant line that was immune to the bean golden mosaic virus (BGMV). We investigated if BGMV-viruliferous whiteflies, would reduce DNA viral amount after feeding on genetically modified (GM) bean plants expressing small interfering RNA (siRNAs) molecules, that target rep gene of the virus. This study demonstrated that BGMV DNA amount was significantly reduced in whiteflies feeding on GM-plants (compared with insects feeding on non-GM plants) over a period of 4 and 8 days at 52% and 84% respectively. The second part of this study aimed to evaluate the RNAi mechanism as a tool to obtain transgenic Nicotiana benthamiana plants with wide resistance to begomovirus infecting tomato in Brazil. For this, a chimeric cassete of interference - that expresses an intron-hairpin RNA (hpRNA) directed to the rep gene of different species of begomoviruses - was developed. The results showed that a higher number of transgenic plants remained uninfected after being challenged with a lower infection pressure of tomato golden vein virus virus (TGVV) (≈ 250 ng/μL viral DNA/plant). Transgenic plants were also inoculated with tomato rugose mosaic virus (ToRMV), tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) and tomato interveinal chlorosis virus (ToICV), and was demonstrated that phenotype resistance to these agents is possibly dependent on transgene zygosis. A proportion of 77% of the transgenic plants that showed resistance phenotype, proved to be homozygous