Diversidade genética de populações de Mycosphaerella musicola e caracterização de efetores LysM em Mycosphaerella graminicola

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015.A bananeira (Musa spp.) é cultivada em mais de 100 países, assumindo importante papel social e econômico, visto que é o fruto mais consumido no mundo. A quinta posição no ranking de produção é ocupada pelo Brasil, onde a Sigatoka-amarela é uma doença comum nos cultivos de bananeiras. Mycosphaerellamusicola(R. Leach ex. J. L. Mulder 1979)(Anamorfo: PseudocercosporamusaeZimm. Deighton), agente causal da doença, é a espécie de Mycosphaerellade maior ocorrência no país em relação às demais espécies. Pouco se sabe sobre a diversidade genética desse patógeno. Similarmente, pouco se sabe sobre a sensibilidade de M. musicolaa fungicidas DMI (inibidores da demetilação). Análises da influência de genes efetores LysM na patogênese de membros do gêneroMycosphaerellatambém são reduzidas. Nesse contexto, os objetivos datese foram verificar a ocorrência de recombinação sexual em populações de M. musicola de 13 diferentes zonas produtoras de banana no Brasil, por meio de análises dos genes matingtypes; caracterizar a diversidade genética das populações com base em 19 locos microssatélites; analisar a sensibilidade dos isoladosa fungicidas DMI e correlacionar o resultado com a ocorrência de mutações no gene CYP51 e, como componente adicional do trabalho, caracterizar o efetor de virulência - LysM em Mycosphaerellagraminicola. Com exceção de isolados coletados em uma das áreas do Distrito Federal e no Rio Grande do Norte, as populações mostraram proporção de 1:1 de genes MAT1-1-1 e MAT1-2-1, indicando a ocorrência de recombinação sexual nessas populações. Alto nível de diversidade genética foi observado entre indivíduos dentro das populações, fato que pode ser resultante da recombinação sexual. Um considerável número de migrantes entre populações de diferentes estados foram observados. Isso indica que ações antrópicas, como o transporte de folhas contaminadas, devem ter contribuído para o fluxo gênico e a homogeneização das populações, considerando que a dispersão por ascósporos é incomum a longas distâncias. A alta fração clonal nas populações sugere que a recombinação assexual emprega um importante papel na estrutura genética e apoia as evidências de dispersão conidial dentro das áreas produtoras de banana. Cinco isolados de M. musicolado Distrito Federal exibiram tolerância aos fungicidas tebuconazole, triadimenol e cyproconazole e um ponto de mutação no aminoácido do códon 461 foi observado nos mesmos isolados. Para a caracterização do efetor LysM, a patogenicidade da linhagem B3 de M. graminicolaexpressando GFP (proteína verde fluorescente) foi avaliada em 18 genótipos de trigo o que permitiu predizer que GFP não influencia na colonização do patógeno. A colonização de B3-GFP em folhas de trigo foi acompanhada via microscopiaconfocal de varredura a laser (CLSM) confirmando que GFP é expressa durante todo o ciclo de infecção do patógeno em folhas de trigo suscetíveis. Uma transformação via Agrobacteriumtumefaciensfoi realizada para a obtenção de uma linhagem B3-GFP mutante não funcional para o gene 3LysM. Entretanto, o DNA homólogo de 3LysM não foi integrado ao sítio alvo no genoma, sendo necessários novos experimentos para a obtenção da linhagem esperada. Os resultados obtidos contribuem para otimizar a compreensão sobre a epidemiologia do patógeno e aprimorar as medidas de controle da doença.Commercial banana varieties (Musa spp.) are cultivated in over 100 countries, assuming important social and economic roles, given that this fruit is the most widely consumed globally. Brazil is the world's fifth largest producer, where yellow Sigatoka is the most common banana disease in production areas. Mycosphaerella musicola (R. Leach ex. J. L. Mulder 1979)(Anamorfo: PseudocercosporamusaeZimm. Deighton), causal organism of the disease, is the most commonly occuring Mycosphaerella species in the country. Limited analysis of genetic diversity of this pathogen has been conducted to date.Similary, little is known regarding fungicide sensitivity of M. musicola to DMI(demethylation inhibitor) fungicides. Analysis of pathogen effector LysM genes and their influence on the pathogenesis of Mycosphaerella members is also limited. In this context, the goals of this study were to verify the occurrence of sexual recombination in M. musicolapopulations from 13 different agroecological zones across Brazil, based on analysis of mating type idiomorphs; characterize population genetic diversity by comparison of 19 microsatellite loci; analyse isolate sensitivity to DMI fungicide and correlate the results with the occurrence of mutations in the CYP51 gene and, as a additional component of the work, characterize the virulence effector – LysM in Mycosphaerellagraminicola. With the exception of isolates collected in one area of the Distrito Federal and Rio Grande do Norte, populations displayed 1:1 proportions of mating type gene idiomorphs MAT1-1 and MAT1-2, indicating the occurrence of sexual reproduction as an evident process in M. musicolapopulations. Greatest genetic diversity occurred among individuals within populations, which may be the result of sexual recombination. A considerable number of migrants between populations from different states were observed. These results indicate that anthropic action such as transport of contaminated germplasm may be contributing to gene flow and the genetic homogenization of populations, when considering that ascospore dispersal is uncommon over large distances. The high clonal fraction in populations suggests that asexual reproduction plays an important role in the genetic structure, supporting documented evidence of conidial dispersal within banana blocks. Five M. musicolaisolates from Distrito Federal exhibited low sensibility to tebuconazole, triadimenol and cyproconazole fungicides, with one point mutation in an amino acid at codon 461 observed across all these isolates. For LysM effector characterization, the pathogenicity of M. graminicolastrainB3 expressing GFP (green fluorescent protein) was evaluated on 18 wheat genotypes, shown that GFP had no influence on pathogen colonization. Colonization of the B3-GFP in wheat leaves was followed via confocal laser scanning microscopy (CLSM). The results confirmed that GFP is expressed during the whole infection cycle of the pathogen on susceptible wheat leaves. Agrobacterium tumefacienswas used to mediate transformation to generate knockout constructs for 3LysM in B3-GFP. The 3LysM homologous DNA was not integrated in the target genomic site, such that continued experiments are required to develop the desired strain for further analysis of the influence of LysM on M. graminicolapathogenesis. The results contribute to our understanding of pathogen epidemiology and contribute to development of enhanced disease control measures