Efeitos da expressão do HIF-1 humano na levedura Saccharomyces cerevisiae

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014.A hipóxia ocorre quando as células são expostas a baixas tensões (< 5%) de oxigênio. Isto afeta o metabolismo, a expressão de genes, a secreção e resposta a hormônios e pode garantir a sobrevivência ou algumas vezes iniciar uma cascata apoptótica. O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) humano regula a transcrição de inúmeros genes envolvidos na resposta à hipóxia e tem importante papel em processos fisiológicos e patológicos. Ele é um heterodímero formado pelas subunidades HIF-1α e HIF-1β, também chamada de transportador nuclear de arilhidrocarbono (ARNT). Em condições de normóxia, o HIF-1 é hidroxilado pelas prolilhidroxilases (PHDs) e marcado para degradação pelo proteasoma. Porém, quando as células se encontram sob hipóxia, as PHDs são inibidas e assim ocorre o acúmulo do HIF-1. Alterações no estado redox podem ter efeito na ativação do HIF-1 e foi verificado que condições de estresse oxidativo podem levar à ativação deste fator. O estresse oxidativo ocorre quando as moléculas antioxidantes e os mecanismos de defesa celular são incapazes de proteger a célula dos efeitos das espécies reativas de oxigênio (EROs) as quais atacam moléculas biológicas vitais, tais como lipídeos, DNA dentre outras. As EROs incluem os radicais livres derivados de oxigênio, entre essas o íon superóxido (O2●-), o radical hidroxila (●OH-), e outras moléculas que embora não possuam elétrons livres são muito reativas devido à sua instabilidade, como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Para estudar os efeitos do HIF-1 sob condições de estresse oxidativo, escolhemos a levedura Saccharomyces cerevisiae, também conhecida como levedura de padeiro. A utilização da levedura S. cerevisiae tem provado ser muito útil como um modelo de sistema in vivo para estudar a ação de fármacos, a expressão de proteínas heterólogas e a função básica de fatores de transcrição humanos. Foram usadas três linhagens mutantes, EG103αβ a qual expressa as duas subunidades do fator de transcrição HIF-1, EG103αΔβ que expressa a subunidade beta truncada e a linhagem EG103M2 que possue o vetor vazio. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta ao estresse oxidativo dessas linhagens de leveduras para aprofundar o conhecimento sobre a regulação da atividade de HIF-1. O crescimento das linhagens foi investigado e os resultados mostraram que a linhagem EG103αβ teve um crescimento menor que as outras duas linhagens (EG103αΔβ e EG103M2) em normóxia. Quando tratada com várias concentrações de H2O2 o crescimento da linhagem EG103αβ diferiu do controle não tratado somente nas concentrações de 1 e 2 mM, quando houve uma diminuição do crescimento. Essa resposta foi similar àquela das outras duas linhagens. Então não foi uma resposta específica da linhagem EG103αβ, indicando que a expressão do HIF-1 não alterou a sensibilidade da resposta ao H2O2. Ao tratar as células com alguns agentes oxidantes como Menadiona (MD), hidroperóxido de cumene (CHP) e terc-butilhidroperóxido (t-BHP) os resultados mostraram que a linhagem EG103αβ apresentava uma susceptibilidade menor à MD na concentração 50 μM, em comparação com as outras linhagens. O uso do inibidor da catalase ATZ (10 mM) e H2O2 0,5 mM mostrou que a susceptibilidade da linhagem EG103αβ aumentou em relacão ao controle tratado somente com H2O2. Nas duas outras linhagens o aumento da susceptibilidade ocorreu com uma concentração menor de ATZ (2 mM) e H2O2 0,5 mM. Isto indica que talvez a linhagem EG103αβ tenha maiores concentrações de catalase em relação às outras duas linhagens. O uso do inibidor da síntese de glutationa, butionina-sulfoximina (BSO) não mostrou uma resposta diferenciada da linhagem EG103αΔβ à exposição ao H2O2. O uso do quelante de ferro, deferoxamina (DFO) também mostrou uma ação de proteção contra o dano oxidativo na linhagem EG103αβ, indicando um papel da ausência de ferro na proteção pelo HIF-1. Medidas dos níveis de glutationa (GSH-eq) e da enzima superóxido dismutase devem ser repetidas para conclusão definitiva de seu papel na linhagem EG103αβ. Em conclusão, os resultados indicam que a expressão das subunidades que compõem o HIF-1 humano em leveduras reduz seu crescimento, aumenta sua resistência à menadiona e talvez os níveis de catalase e faz com que um quelante de ferro tenha papel protetor nestas células. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACTHypoxia occurs when cells are exposed to low oxygen tensions (