Desenvolvimento e padronização de métodos para detecção de Trypanosoma cruzi em polpa de açaí (Euterpe oleracea)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, 2015.A tripanossomíase americana ou doença de Chagas (DC) é uma doença que afeta principalmente a população pobre de países latino americanos. Estima-se que 7-8 milhões de pessoas estão infectadas com Trypanosoma cruzi na América Latina, sendo que cerca de 2 a 3 milhões de pessoas são portadoras da forma crônica no Brasil. Apesar da realização do controle da transmissão vetorial da DC em regiões endêmicas, formas alternativas de transmissão tornaram-se evidentes como a transmissão oral. A transmissão oral ocorre principalmente pela ingestão acidental de triatomíneos infectados ou de alimentos contaminados com dejetos desses triatomíneos ou secreções de animais silvestres infectados com T.cruzi. O suco do açaí produzido artesanalmente é tido hoje como o principal responsável por surtos da DC no Norte do Brasil, pequenos surtos da DC já foram registrados após grupo de pessoas ingerirem a bebida contaminada com T.cruzi nos estados do Amapá, Amazonas e Pará. O objetivo desse trabalho é desenvolver e validar uma metodologia para detectar contaminação por T. cruzi em pasta e bebida de açaí (Euterpe oleracea). Para isto, 10 mL de polpa de açaí foram inoculados com 107 células de formas epimastigotas ou tripomastigotas de T.cruzi, que foram posteriormente isoladas por flutuação em sulfato de zinco, seguido de extração de DNA e análise por PCR. Para a detecção, foram amplificadas as regiões repetitivas do DNA nuclear (TCZ) e o gene ribossomal 28Sα (rDNA 28Sα). Também foram avaliadas a sensibilidade e a especificidade dos primers. A extração de DNA pelo método clorofórmio/álcool isoamílico foi testada após amostras serem isoladas por flutuação em Sulfato de zinco. O limite mínimo de detecção utilizando o gene ribossomal rDNA 28Sα foi observado na ordem de 20 pg de DNA de T. cruzi, enquanto que para as regiões repetitivas nuclear TCZ foi de 20 fg. Os números mínimos detectados de células em 10 mL de polpa de açaí foram: 170.000 tripomastigotas para rDNA 28Sα e 1,7 tripomastigotas para o TCZ. O limite de detecção para a amplificação do gene rDNA 28Sα foi de 400 fg em PCR em tempo real (qPCR) e o número de células detectadas foram 10.000. A metodologia de isolamento de T. cruzi pela flutuação em sulfato de zinco, juntamente com a amplificação de regiões repetitivas do DNA nuclear (TCZ) e do gene ribossomal (rDNA 28Sα) por PCR qualitativa e qPCR, demonstraram ser uma ferramenta aplicável para a detecção de açaí contaminado com T. cruzi. A utilização desta metodologia pode ser apropriada em casos de surtos de transmissão de doença de Chagas por via oral.The American trypanosomiasis or disease of Wounds (DC) is a disease that affects mainly the poor population of Latin American countries. It is estimated that 7-8 million persons are infected with Trypanosoma cruzi in the Latin America and around 2 to 3 million persons have the chronic form in Brazil. Despite the accomplishment of the control of the vector transmission for DC in endemic regions, the alternative forms of transmission became evident like the oral transmission. The oral transmission occurs by accidental ingestion of infected triatomines, foods contaminated with feces of these triatomines or secretions of wild animals infected with T. cruzi. The craftily produced açaí (Euterpe oleracea) juice is considered the main responsible for outbreaks of the DC in the North of Brazil. Small outbreaks of the DC were already registered after groups of persons ingested the juice contaminated with T. cruzi in the states of Amapá, Amazon and Pará. The main objective of this work is to develop and to validate a methodology to detect T. cruzi contaminations in açaí-based foods and beverages. For this, 10 mL of açaí pulp were inoculated with 107 T. cruzi epimastigote or trypomastigote cells, which were subsequently isolated by flotation in zinc sulfate. Next, the extraction of DNA and PCR analysis were conducted. For PCR detection, the repetitive regions of the nuclear DNA (TCZ) and the ribosomal gene 28S α (rDNA 28S α) were amplified. Moreover, the especificity and sensibility of the primers were determined. The method using chloroform/isoamyl alcohol was chosen for T. cruzi DNA extraction from açaí samples. The minimum detection limit for the ribosomal gene rDNA 28Sα was observed in the order of 20 pg of T. cruzi DNA, while for the nuclear repetitive regions TCZ it was 20 fg. The minimum number of cells detected in 10 mL of açaí pulp were 170,000 trypomastigotes for rDNA 28Sα and 1.7 trypomastigotes for TCZ. The detection limit for the amplification of the rDNA 28Sα gene was 400 fg by real time PCR (qPCR) and the number of detected cells were 10,000. The methodology of T. cruzi isolation by flotation in zinc sulfate followed by the amplification of repetitive regions of the nuclear DNA (TCZ) and the ribosomal gene (rDNA 28S α) by qualitative PCR and qPCR, demonstrated to be an applicable strategy to detect T. cruzi contaminations in açaí-based foods and beverages. The application of this methodology can be appropriated in cases of outbreaks of Chagas disease transmission by oral route