Prospecção da peçonha do escorpião Tityus fasciolatus sob a perspectiva proteômica e transcritômica, e caracterização biológica de peptídeos moduladores de canais de Na+

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2014.O escorpião Tityus fasciolatus faz parte da família Buthidae, que contém espécies causadoras de envenenamentos graves em humanos. As moléculas responsáveis pelos efeitos mais severos são conhecidas como neurotoxinas que, em sua maioria, são componentes peptídicos cujos principais alvos são os canais iônicos, os quais são relevantes para o funcionamento dos diversos sistemas orgânicos. Os compostos relacionados aos envenenamentos por peçonhas de escorpiões são conhecidos por agirem com especificidade nos canais iônicos. Os constituintes proteicos de T. fasciolatus foram caracterizados com o auxílio de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC), com coluna C18 analítica, espectrometria de massa MALDI/ TOF-MS e uma biblioteca transcritômica da glândula de peçonha. Mais de 200 diferentes massas moleculares foram identificadas nas frações cromatográficas, assim como 9.130 transcritos na biblioteca transcritômica, dentre os quais foram identifcados 278 que codificam toxinas. A atividade biológica de três toxinas e de uma fração foram testadas com canais iônicos expressos em oócitos de Xenopus laevis, através da técnica de Voltage clamp de dois eletrodos. Foram utilizados canais de Na+ de mamíferos hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 e rNav1.8/1. Duas toxinas (Tf3 e Tf4) foram classificadas como -NaScTx (Sodium Scorpion Toxins), por causarem aumento da corrente de Na+ e retardo da inativação rápida do canal. A Tf3 foi ativa em hNav 1.1 à hNav1.7, enquanto a Tf4 agiu apenas nos hNav1.2 e hNav1.7. A fração 63 também apresentou atividade α, sendo sua atividade significativa em hNav1.7. A toxina Tf2 foi identificada como -NaScTx, cuja característica é a ativação dos canais de Na+ em potenciais onde antes os canais estavam em repouso. Dentre os oito canais de Na+ de mamífero testados, a Tf2 foi seletiva para hNav1.3, à concentração de 1M. Além da descrição da atividades dessas toxinas de Na+, este trabalho gerou um acervo de sequências de nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, um perfil das massas moleculares associadas aos seus respectivos tempos de retenção, 18 sequências de prováveis NaScTxs e 15 sequências de prováveis KTxs.Tityus fasciolatus is a scorpion belonging to the Buthidae family, known by the species that cause severe evenomation in humans. The molecules responsible for the most severe effects are known as neurotoxins, which are mostly peptide components, targeting ion channels, which are relevant to the functioning of the various organ systems. The compounds responsible for envenomation are usually known to act with specificity on ion channels. The proteic components of T. fasciolatus venom were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), MALDI/TOF mass spectrometry and a transcriptomic library of the venom gland. More than 200 different molecular masses were detected in chromatographic fractions, as well as 9,130 transcripts that encode compounds, among them 278 encode toxins. Two Electrodes Voltage Clamp was used to test the biological activity of three toxins and a fraction in Xenopus laevis oocytes expressing ion channels. The Nav channels used were all mammals, hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 and rNav1.8/1. Two toxins (Tf3 and Tf4) were classified as -NaScTx (Sodium Scorpion toxins), since they cause an increase in Na+ currents and a delay in the rapid inactivation of the channel (Tf3 and Tf4). The Tf3 was active in hNav 1.1 to hNav1.7, while Tf4 affected only hNav1.2 and hNav1.7. Fraction 63 also showed α activity in hNav1.7. Tf2 was identified as β-NaScTx, whose characteristic is the activation of Nav channels at more negative potentials. Among the eight mammal Nav channels tested, Tf2 was hNav1.3 selective, at 1μM. This work led to a collection of sequences of nucleotides and amino acid residues, a molecular mass profile with their respective retention times, and 18 putative NaScTxs and 15 putative KTxs sequences