Identificação e avaliação do potencial de uso de isolados de Trichoderma contra Sclerotinia sclerotiorum e Sclerotium rolfsii

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014.O Brasil se destaca no cenário mundial como um dos principais produtores de feijão. Entretanto, vários problemas fitossanitários contribuem para redução da renda líquida auferida na exploração da cultura, entre os quais, o mofo branco e a podridão de escleródio, causadas pelos fungos Sclerotinia sclerotiorum (SS) e Sclerotium rolfsii (SR), respectivamente, reconhecidas como principais doenças do feijão. O controle biológico, pelo uso de Trichoderma tem sido proposto como um dos métodos de manejo das doenças. Espécies desse gênero possuem grande importância agronômica e atuam como decompositores primários de matéria orgânica, destacando-se também pela produção de metabólitos e enzimas com propriedades antifúngicas. Em face disso, o trabalho foi conduzido com o objetivo de identificar isolados de Trichoderma com potencial de uso contra SS e SR. Cento e quarenta e nove isolados foram testados in vitro e 50 destes foram pré-selecionados e identificados com base no seqüenciamento das regiões ITS e TEF do rDNA. Dentre esses, foram identificadas sete espécies do gênero Trichoderma: T. harzianum, T. stromaticum, T. koningiopsis, T. asperellum, T. tomentosum, T. spirale e T. erinaceum. Vinte isolados foram testados em casa de vegetação. Resultados desse estudo mostram que, in vitro, 10,6% dos isolados testados contra SS e 14% contra SR apresentaram nota 1 no pareamento de cultura; 15,33% dos isolados para SS e 4,6% para SR mostram níveis elevados de antagonismo quanto a inibição micelial do patógeno por metabólitos não-voláteis. Dos 20 isolados selecionados para os estudos em casa de vegetação, quatro se destacaram: CEN207 (T. koningiopsis), CEN188 (T. spirale), CEN200 (T. koningiopsis) e CEN189 (T. spirale) sobre os demais quanto a promoção de crescimento. A técnica de identificação por MALDI TOF MS foi utilizada com oito dos isolados de Trichoderma previamente identificados com base no sequenciamento de fragmentos do DNA, agrupando-se de acordo com as espécies, conforme o esperado e formando clados no dendograma. Metabólito bruto extraído do isolado CEN277 (T. asperellum) foi analisado em HPLC e mostrou grande potencial quanto à inibição do crescimento micelial de S. sclerotiorum. As técnicas utilizadas com cromatografia líquida e MALDI TOF MS, embora iniciais, proporcionaram resultados interessantes e necessitam de mais dedicação para a obtenção de resultados conclusivos na identificação das moléculas envolvidas.Brazil stands out in the global scenario as one the leading producers of beans. However, many phytossanitary problems contribute to a reduction of yield, including white mold and sclerotia rot, caused by the fungi Sclerotinia sclerotiorum (SS) and Sclerotium rolfsii (SR) respectively, whith are recognized as major bean diseases. Biological control using Trichoderma has been proposed as a method of managing these diseases. Species of this genus are, of great agronomic interest and act as primary decomposers of organic material and are, also highlighted by the production of enzymes and metabolites with antifungal properties. For this reason, this study was conducted in order to identify Trichoderma isolates able to implement the biocontrol of these diseases. One hundred forty-nine isolates were tested in vitro and 50 of these were pre-selected and identified based on sequencing of the TEF and ITS regions of rDNA. Seven species of Trichoderma have been identified based on molecular characterization: T. harzianum, T. stromaticum, T. koningiopsis, T. asperellum, T. tomentosum, T. spirale and T. erinaceum. Among fifty isolates, 20 were tested under greenhouse conditions. Results of this study show that, in vitro, 10.6% of the isolates tested against SS and 14% against SR reached note 1 in paired culture; 15.33% of the isolates for SS and 4.6% for SR show elevated levels of antagonism regarding pathogen mycelial inhibition by non-volatile metabolits. From 20 isolates selected for studies under greenhouse conditions, four stood out compared to others, as promoting growth: CEN207 (T. koningiopsis), CEN188 (T. spirale), CEN200 (T. koningiopsis) and CEN189 (T. spirale). The technique of identification by MALDI TOF MS was used with eight isolates of Trichoderma previously identified based on DNA sequencing, grouped according to the species, as expected forming a clade on the dendrogram. Crude metabolite extracted from the CEN277 (T. asperellum) was analyzed by HPLC and showed great potential for the inhibition of mycelial growth of S. sclerotiorum. The techniques used in liquid chromatography and MALDI TOF MS, although preliminars, have provided interesting results and motivate further studies to identils the involved molecule