Analysis of the effect of Ischemia and reperfusion on neutrophil proteome in rats

Tese (doutorado)—University of Brasília, Department of Cell Biology, Postgraduate in Molecular Biology, 2014.Lesão por isquemia e reperfusão é um modelos amplamente usados que resulta em disfunção tecidual e falha do órgão especialmente após trauma e cirurgia, enquanto que neutrófilos desempenham papel importante no mecanismo de lesão causada por isquemia e reperfusão. No entanto, o efeito da isquemia e reperfusão na estimulação e ativação de neutrófilos ainda não é claro. A análise proteômica tem sido ratificada como uma ferramenta adequada no estudo de sistemas complexos, tais como a estimulação e ativação de neutrófilos, portanto o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da isquemia e reperfusão no proteoma de neutrófilos e nos parâmetros hematológicos em ratos Wistar. Três grupos de neutrófilos foram separados: controle, laparotomia e isquemia/reperfusão intestinal. Proteínas foram extraídas de acordo com o protocolo FASP, digeridas com tripsina e marcadas com iTRAQ. Fosfopeptídios foram enriquecidos pelo procedimento TiO2-SIMAC-HILIC. Peptídios fosforilados e não fosforilados foram fracionados por HILIC antes da análise por LC-MS/MS. Procedimentos de LC-MS/MS e bioinformática foram aplicados para quantificação dos peptídeos, designação do sitio de fosforilação e identificação proteica. Foi identificado um total de 3816 proteínas contendo 2231 proteínas exclusivamente não fosforiladas, 892 exclusivamente fosforiladas e 693 presentes tanto no proteoma total quanto no fosfoproteoma. No total 1585 proteínas fosforiladas foram identificadas, representando 41,5% da fosforilação de proteínas no proteoma total de neutrófilos identificado nesse estudo. A classificação das proteínas reguladas por ontologia genética mostrou mudanças no proteoma de neutrófilos conferidas pelos grupos experimentais. Nós pudemos identificar atividades enzimáticas e vias de sinalização relevantes envolvidas na ativação de neutrófilos após isquemia intestinal e reperfusão. A maior parte das enzimas reguladas no proteoma de neutrófilos de rato são transferases, hidrolases e oxidoredutases. Vias identificadas na base de dados KEGG e contendo diversas proteínas reguladas incluem a ribossomal, regulação de actina do citoesqueleto, fagocitose mediada por Fc-gama-R, sinalização por quimocina, vias de fosforilação oxidativa e metabólica. Nossos resultados fornecem base para compreender pela primeira vez os efeitos de isquemia e reperfusão no proteoma de neutrófilos e os mecanismos envolvidos no processo. __________________________________________________________________________________ ABSTRACTIntestinal Ischemia and reperfusion injury are widely used models, which results into tissue dysfunction and organ failure especially after trauma and surgery. Whereas neutrophils play an important role in the mechanism of injuries caused by ischemia and reperfusion. However, the effect of intestinal ischemia and reperfusion on stimulation and activation of neutrophils is still unclear. Proteomic analysis has been ratified as an appropriate tool to studying complex systems, such as stimulation and activation of neutrophils, so the objective of this work was to evaluate the effect of ischemia and reperfusion on neutrophil proteome in Wistar rats. For proteomic neutrophils from three groups; control, laparotomy, and intestinal ischemia/reperfusion were separated. Protein was extracted according to FASP protocol, trypsin digested, iTRAQ-labeled. Phosphopeptides were enriched by TiO2-SIMAC-HILIC procedure. Non-phosphorylated and mono-phosphorylated peptides were HILIC fractionated prior to LC-MS/MS analysis. LC-MS/MS and bioinformatics procedures were applied to peptides for their quantitation, phosphosite assignment and protein identification. A total of 3816 proteins containing 2231 non-phosphorylated unique proteins and 892 unique phosphorylated proteins whereas 693 phosphorylated proteins were identified in both total and phosphoproteome. In total 1585 phosphorylated proteins were identified, representing 41.5% of protein phosphorylation of the total neutrophil proteome identified in this study. We aimed to bring further light to this process by analyzing hematological parameters after ischemia and preconditioning. Gene ontologies for all the regulated proteins represented changes confer by the experimental groups on neutrophil proteome. We could identify the relevant predicted enzyme activities and pathways involved in neutrophils activation after intestinal ischemia and reperfusion. Most of the regulated predicted enzymes of the rat neutrophil proteome are transferases, hydrolases and oxidoreductases. Important pathways from KEGG analysis include ribosomal, regulation of actin cytoskeleton, Fc gamma R-mediated phagocytosis, chemokine signaling, metabolic and oxidative phosphorylation pathways. We also aimed to bring further light to this process by analyzing hematological parameters after ischemia and preconditioning. Our findings provide platform for the first time to understand the effects of intestinal ischemia and reperfusion on neutrophil proteome and mechanism involve in this process