Uso do gene amdS (acetamidase) como marca de seleção dominante em Pichia pastoris

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2015.A levedura Pichia pastoris tem sido bastante explorada na produção de proteínas heterólogas, graças a algumas vantagens apresentadas por esse sistema, tais como: técnicas de manipulação genética disponíveis, crescimento em altas densidades celulares, realização de modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas. Contudo, esse sistema ainda possui algumas limitações no que se refere às ferramentas de genética molecular. Por exemplo, para que diversas modificações sejam introduzidas na mesma linhagem, faz-se necessário o uso de múltiplas marcas de seleção ou de estratégias que permitam a sua reutilização. Em Pichia, o uso de marcas recicláveis ainda é limitado. Nesse contexto, destaca-se o gene amdS (acetamidase) de Aspergillus nidulans, que permite a seleção de fungos em meio de cultura contendo acetamida como única fonte de nitrogênio e a contrasseleção em meio contendo a droga fluoroacetamida. Em conjunto com a contrasseleção do gene amdS, o sistema Cre-loxP de recombinação sítio-específica pode ser utilizado para facilitar a excisão da marca de seleção. Neste trabalho, o uso da marca amdS foi testado em P. pastoris e, como prova de conceito, foi feita a deleção do gene ADE2, uma carboxilase envolvida na síntese “de novo” de purinas. Primeiramente, uma ORF endógena que codifica para uma amidase putativa foi deletada. Em seguida, foi construído um vetor contendo um cassete com o gene amdS flanqueado por sítios loxP além do gene repórter EGFP para testar a eficiência da marca em P. pastoris. A construção amdS-loxP foi também utilizada em cassetes de deleção para os genes ADE2 e URA5. Após a deleção do gene ADE2, um plasmídeo replicativo contendo o gene da recombinase CreA (pYRCre2) foi utilizado para a excisão da marca, para permitir a reutilização do gene amdS em outros eventos de deleção. A integração do vetor contendo o gene amdS mostrou que esta nova marca de seleção é aplicável em P. pastoris com a vantagem de permitir a contrasseleção de transformantes após o uso do sistema de recombinação Cre-loxP. Esta nova ferramenta traz alternativas na manipulação genética da levedura reduzindo problemas como a necessidade de expressão de diversas marcas dominantes.The yeast Pichia pastoris has been widely explored for the production of heterologous proteins due to certain advantages presented by this system, such as: molecular genetic techniques available, growth at high cell densities, post-translational modifications and efficient protein secretion. However, this system still has some limitations related to the tools used for genetic modifications. For example, in order for many genetic modifications to be done in the same strain, one needs to use multiple selection marks or strategies that allow marker reusing. In Pichia, the use of recyclable markers is still limited. The amdS gene from Aspergillus nidulans stands out in this context because it allows the selection of fungi in medium that contains acetamide as sole nitrogen source, as well as the counterselection in medium that contains the drug fluoroacetamide. Along with the counterselection property of the amdS gene, the Cre-loxP site-specific recombination system can be used to help in selection marker excision. In this work, the amdS selection mark was tested in P. pastoris and, as proof of concept, the ADE2 gene coding for a carboxylase involved in purine synthesis was deleted. Firstly, an endogenous ORF coding for a putative amidase was deleted. Subsequently, a vector containing a cassette with the amdS gene flanked by loxP sites and a EGFP gene was constructed in order to test the selection marker in P. pastoris. The amdS-loxP construction was also used in deletion cassettes for ADE2 and URA5 genes. After the ADE2 gene deletion, a replicative plasmid containing the CreA recombinase gene (pYRCre2) was used for marker excision, allowing the use of the amdS gene in further gene deletion events. Integration of the vector containing the amdS gene showed that this new selection marker is applicable in P. pastoris with the advantage of allowing counterselection after using the Cre-loxP recombination system. This new tool brings an alternative for P. pastoris genetic manipulation, reducing problems such as the expression of many dominant selection markers simultaneously