Etiologia, diversidade do agente causal e controle químico da antracnose da soja

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014.A soja (Glycine max) é considerada a mais importante cultura do agronegócio brasileiro. Se consideradas as lavouras contíguas da Argentina, atualmente mais de 50% da produção mundial de soja é procedente da América do Sul. Dentre diversas doenças, tem aumentado a prevalência e a intensidade da antracnose, causada principalmente por Colletotrichum truncatum. Relatos de epidemias severas, com expressiva redução de produtividade, são frequentes, especialmente nos plantios da região Centro-Norte. Pouco se sabe sobre a variabilidade morfológica, cultural e molecular de C. truncatum e de outras espécies associadas à antracnose da soja no cone sul da América do Sul. Desta forma, as características morfo-moleculares de 54 isolados de C. truncatum provenientes de regiões produtoras de soja do Brasil e da Argentina foram investigadas. Estudos morfométricos e culturais de C. truncatum, assim como o uso de RAPD, confirmam a existência desta diversidade nos isolados de C. truncatum. Alguns isolados apresentaram três tipos de conidiogênese, incluindo a formação de conídios através de células conidiogênicas nas extremidades das hifas, em conidiomas no interior de esporodóquis setosos, através de setas férteis ,e forma inédita para a espécie C. truncatum. O sistema RAPD foi eficaz para detectar a diversidade genética dos isolados de C. truncatum provenientes da América do Sul e para estabelecer o grau de similaridade entre eles. Este foi maior dentro do grupo de isolados provenientes da Argentina e menor dentro do grupo de isolados do Brasil. Além disso, os resultados correlacionaram diferentes grupos com a respectiva origem geográfica, com agrupamentos exclusivos ou quase exclusivos de isolados das províncias argentinas e brasileiras em grupos distintos. Além disso, foi reportada e caracterizada a patogenicidade de Colletotrichum cliviae, espécie de conídios cilíndricos, à soja, em comparação com C. truncatum e outras espécies de Colletotrichum. Um isolado de C. clivae originário do Estado do Tocantins foi caracterizado morfologicamente e sua relação filogenética com C. truncatum e outras espécies foi estabelecida pelo sequenciamento parcial das regiões genômicas: quitina sintetase (CHS-1), B-tubulina2 (TUB-2), gliceraldeído-3 fosfato desidrogenase (GPDH), calmodulina (CAL), Actina (ACT) e rDNA ITS (ITS) e as sequências obtidas foram comparadas com sequências de outras espécies de Colletotrichum depositadas no GeneBank. Foram evidenciados clados de Colletotrichum associados à soja através da análise filogenética gerada a partir da análise de parcimônia. A análise filogenética agrupou o isolado de Tocantins com isolados de C. cliviae, com formação de subgrupos, indicando a existência de linhagens. A patogenicidade deste isolado, juntamente com cinco outros isolados de C. truncatum foi comparada em 16 genótipos de soja e diferenças de agressividade foram detectadas. Este é o primeiro relato de C. clivae como agente etiológico da antracnose em soja e o primeiro relato da espécie no Brasil. Foi obtida a formação in vitro da fse ascógena de C. clivae, pertencente a uma espécie do gênero Glomerella. Esta descoberta reforça o conceito que a antracnose em soja é causada por um complexo de espécies de Colletotrichum, tanto de conídios falcados quanto cilíndricos. As perdas devidas à doença no Brasil permanecem inderteminadas. Ainda, são frequentes os relatos de campo sobre a baixa eficiência de fungicidas para o controle da antracnose. Desta forma, testou-se a eficácia de fungicidas atualmente registrados para a cultura, bem como foram estimadas as perdas nas condições avaliadas. Foram conduzidos ensaios em lavouras comerciais em Alvorada, TO em duas safras consecutivas, com a cv. M-Soy 9144 RR. O delineamento utilizado foi o de blocos casualizados com quatro repetições e parcelas de 18 m2 (seis linhas de seis m). Foram realizadas duas aplicações de fungicidas, nos estádios R1/R2 e R5.2, e avaliados 10 produtos comerciais registrados para a cultura. A incidência de vagens sintomáticas foi determinada em R6. Na safra 2010/2011, apenas Azoxistrobin + Ciproconazol apresentou índices de incidência da doença significativamente menores do que a testemunha, a qual não diferiu dos demais tratamentos. Na safra 2011/2012 não houve diferenças significativas entre os tratamentos e a testemunha. As incidências em vagens nas duas safras variaram entre 10.7-15.6% e 9.5-16.3% respectivamente. As produtividades variaram entre 3.288 e 3.708 Kg ha-1 nas testemunhas e máximos de 3.966 e 4.110 Kg ha-1 nas parcelas tratadas, respectivamente em 2010/2011 e 2011/2012. Foram detectadas fortes e significativas correlações negativas entre a produtividade e a incidência da antracnose (r entre 0,81 e 0,85 nas duas safras). Análise de regressão indicou que a cada 1% de incremento da doença, cerca de 90 Kg/ha de grãos foram perdidos. Conclui-se que é alta a diversidade de C. truncatum, principal agente causal da antracnose da soja na América do Sul e que populações desta espécie estão possivelmente estruturadas geograficamente; que a espécie C. clivae é patogênica à soja e ocorre em condições naturais no norte Brasil; que a doença é responsável por perdas significativas de produção e que o controle químico com fungicidas sintéticos é insuficiente como único método de manejo da doença.Soybean (Glycine max) can be arguably considered the most important Brazilian field crop. If the contiguous Argentinian crops are included, more than 50% of the world´s production comes from South America. Among several diseases, the prevalence and intensity of anthracnose, caused mainly by Colletotrichum truncatum, is increasing. Reports of severe epidemics, with expressive yield loss are frequent, especially from North-Central Brazil, but the reasons for these are not known. Knowledge about the morphological, cultural and molecular variability of C. truncatum and other anthracnose-related species associated to soybean in South America is scarce. Therefore, the morpho-molecular characteristics of 54 South American isolates of C. truncatum were studied in Chapter I. RAPD was used for estimating the genetic variability of the isolates. Results demonstrated morphological, cultural and genetic diversity of C. truncatum. Some isolates presented three types of conidiogenesis, including conidial formation from conidiogenous cells on hyphal extremities, in conidiomas in acervuli and in a yet-unreported manner for C. truncatum, directly from fertile setae. RAPD was efficient in detecting the genetic diversity present in the collection of C. truncatum isolates from South America, and was capable of establishing the degree of intra-group similarity, which is greater in the group of Argentinian isolates as compared to the group of Brazilian isolates. Furthermore, the results evidenced the correlation of geographical origin with molecular grouping, with the exclusive or semi-exclusive assembling of Brazilian and Argentinian isolates in distinct clades. Chapter 2 aimed at the description and pathogenic characterization of Colletotrichum cliviae (a cylindrical conidia species), as a yet unreported soybean pathogen, in contrast with C. truncatum. One isolate of C. clivae, from the state of Tocantins was characterized morphologically and its phylogenetic relation to C. truncatum and other Colletotrichum species was established, by means of comparison of fragments of the genomic region of the following genes: chitin synthetase (CHS-1), B-tubulin 2 (TUB-2), glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase (GPDH), calmodulin (CAL), Actin (ACT) and rDNA ITS (ITS), which were compared to the deposited sequences of several species of Colletotrichum at the GeneBank. Several clades of Colletotrichum associated to soybean were detected through parsimony analysis. The phylogenetic analysis clustered the TO isolate with other C. cliviae isolates, albeit with the formation of subgroups, indicating the presence of fungal lines. Pathogenicity and aggressiveness of the C. clivae isolate was compared with other five C. truncatum isolates, on 10 soybean genotypes, and differences in aggressiveness were detected. This is the first report of C. clivae as an etiological agent of soybean anthracnose, and the first report of the species in Brazil. The teleomorph of C. clivae was obtained in vitro and corresponds to the genus Glomerella. This finding reinforces the concept that the etiology of soybean anthracnose is complex, involves several Colletotrichum species, including species with falcate and cylindrical conidia. A systematic study of soybean losses due to anthracnose has not been attempted in Brazil. However, field reports of low fungicide efficiency against the disease are frequent. Therefore, the objective of Chapter 3 was to elucidate the level of efficiency of present-day fungicides to control the disease and estimate grain yield lost due to anthracnose. Field studies were carried out for two consecutive years in commercial crops in Alvorada County, TO, on cv. M-Soy 9144 RR. A complete randomized experimental design was used, with four replicates and 18 sq-m plots (six 6-m lines). Fungicides were applied twice, at phenological stages R1/R2 and R5.2. Ten commercial formulas, approved for use in soybean were evaluated. The incidence of symptomatic pods was determined at R6. In the 2010/2011 season, only Azoxistrobin + Cyproconazole resulted in disease levels significantly lower than in the non-sprayed control plots, but it did not differed significantly from the other treatments. In the 2011/2012 season, there were no differences among synthetic fungicide treatments and the non-sprayed control plots. The incidences of symptomatic pods varied between 10.7-15.6% and 9.5-16.3% in each respective planting season. Grain yields varied between 3,288 and 3,708 Kg ha-1 in the non-sprayed plots and maxima between 3,966 and 4,110 Kg ha-1 in treated plots, in 2010/2011 and 2011/2012, respectively. There were strong and statistically significant negative relations between grain yield and anthracnose incidence (r between 0.81 and 0.85 in the two seasons). Regression analysis indicated that for each 1% increment in disease incidence, c. 90 Kg of grain is lost per hectare. The following conclusions are offered: Populations of C. truncatum, the main etiological agent of soybean anthracnose in South America, are diverse and possibly geographically structured; C. clivae is pathogenic to soybean, and occurs naturally in field crops of Northern Brazil; Anthracnose is responsible to significant yield losses and chemical control by synthetic fungicides is insufficient for disease manage as the sole method of control