Aspergillus section Flavi : molecular characterization of aflatoxigenic species in Brazil nut and analysis of the transcriptome in Aspergillus oryzae in relation to enzymatic degradation of sugarcane bagasse

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014.Fungos do Gênero Aspergillus da seção Flavi são conhecidos por compreenderem espécies com cabeça conidial entre o amarelo esverdeado à marrom e esclerótia escura. A taxonomia desse grupo é complexa e está evoluindo continuamente. Dois grupos têm sido descritos nessa seção: O primeiro composto pelas espécies Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius, Aspergillus pseudotamarii, Aspergillus bombycis, Aspergillus parvisclerotigenus, Aspergillus arachidicola e Aspergillus minisclerotigenes, conhecidos pela capacidade de produção de aflatoxinas; e a segunda composta por Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus tamarii e Aspergillus caelatus, espécies que não produzem aflatoxinas. Aflatoxinas são metabólicos secundários tóxicos produzidos por Aspergilli quando em condições de temperatura e umidade favoráveis. Contaminações da castanha do Brasil, castanha de caju e amendoim devem-se principalmente por fungos que produzem aflatoxinas, primariamente por espécies do grupo de Aspergillus da seção Flavi. O A. oryzae é uma espécie economicamente importante usado com um amplo espectro de aplicações tecnológicas em escala industrial. A preparação de produtos de alimentos fermentados e a produção de enzimas hidrolíticas que atuam na conversão da biomassa de resíduos agroindustriais como o bagaço de cana de açúcar, em açúcares fermentáveis, para a aplicação na produção do biocombustível de segunda geração são as suas principais aplicações. No nível molecular, A. oryzae é relacionado próximo à A. flavus. Esse trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de um método de diagnótico molecular para espécies aflatoxigênicas membro do grupo Aspergillus da seção Flavi, a investigação da diversidade nucleotídica de genes da via biossintética da aflatoxina de isolados de A. flavus em relação à produção de aflatoxina, e a caracterização do transcritoma de A. oryzae BLU37, uma estirpe promissora para a produção de enzimas lignoceluloliticas. Isolados de fungos foram coletados a partir de castanha do Brasil, castanha de caju e amendoim contaminados através de quatro Estados brasileiros. Isolados pertencentes ao Gênero Aspergillus foram identificados baseados em sua morfologia. Uma identificação molecular foi conduzida pela análise da sequência da região rDNA ITS. Um método molecular para a identificação específica de membros produtores de aflatoxinas de Aspergillus da seção Flavi, os quais ocorrem na castanha do Brasil, foi desenvolvido por meio da digestão restritiva de amplicons da região mtDNA SSU rDNA. Um total de 80 isolados de A. flavus a partir da castanha do Brasil, castanha de caju e amendoim foram caracterizados quanto a aflatoxigenicidade quando submetidos a condições ambientais indutoras da produção de aflatoxina. Esses isolados foram cultivados por sete dias à 28C em culturas semi-sólidas em meio YES, atividade de água 0,99 e analisados por meio de CLAE-FLD. Treze pares de primers foram desenhados com cobertura completa de três genes da via biossintética de A. flavus. Os genes são: o fator de transcrição aflR e dois genes, aflP e aflQ, que codificam enzimas precursoras envolvidas na conversão da aflatoxina. Um total de 13 isolados produtores e 13 não produtores de aflatoxinas, previamente estabelecidos para a produção de aflatoxinas por CCD, tiveram o gene aflR parcialmente seqüenciado. A edição das sequências, alinhamento e identificação de polimorfismos SNP foi conduzida udando o programa Sequencher v4.8 (Gene Codes Corporation). A diversidade nucleotídica intra-específica baseada na freqüência de SNP foi usada para definir haplótipos e desequilíbrio de ligação por meio do programa Tassel. Entender a diversidade nucleotídica entre A. flavus produtor e não produtor de aflatoxina é importante para o desenvolvimento de sistemas de diagnose molecular a serem aplicados em estratégias adequadas de prevenção e controle. Análise do transcritoma do isolado A. oryzae BLU37 foi examinada a partir de culturas in vitro cultivadas em diferentes fontes de carbono. Uma suspensão de esporos a concentração final de 1 x 1010 esporos/mL foi usada para inocular culturas líquidas e semi-sólidas em meio mínimo e fonte específica de carbono [glucose 0,5% (w/v); bagaço de cana pré-tratado 0,5% (w/v) (pH 7,0)]. As culturas foram incubadas à 28C por um período de 36 e 48 horas pós inóculo, totalizando oito tratamentos distintos, cada um conduzido em duplicata. Seguida o isolamento do RNA total a partir do micélio do fungo coletado, o isolamento do mRNA, preparo de enriquecimento das 16 bibliotecas de cDNA e RNA-Seq Illumina (www.Illumina.com) foram conduzidos em colaboração com a empresa Eurofins MWG Operon (Alabama, USA). Leituras processadas de qualidade foram mapeadas ao genoma de A. oryzae RIB40 (National Research Institute of Brewing Stock Culture ATCC-42149). Um total de 68,67 Gbases de dados de sequencias de qualidade processados foram gerados a partir de 16 bibliotecas de cDNA seqüenciadas, com uma média de 50,2 milhões de leituras de sequências por biblioteca e uma media de comprimento de leitura de 80,34 pb. O banco de dados CAZy (http://www.cazy.org/) foi empregado de modo a definir todas as hidrolases glicosídicas (GHs), Glicosil Transferases (GT), polissacarídeo liases (PLs), carboidrato esterases (CEs) e Módulos de Ligação a Carboidratos (CBM) expressas por A. oryzae BLU37 sob os diferentes tratamentos. Um total de 202 genes pertencentes às famílias CAZy foram encontrados. A partir do banco de dados Fungal Transcription Factor Database (http://ftfd.snu.ac.kr/index.php?a=view), 44 genes pertencentes à cinco famílias de fator de transcrição, foram encontrados. Esse estudo contribuirá para o entendimento da complexidade do transcritoma de A. oryzae, um fungo de importância para produção de enzimas com um amplo espectro de aplicações tecnológicas, principalmente para a aplicação desse fungo no desenvolvimento de biocombustível de segunda geração a partir de resíduos agroindustriais. __________________________________________________________________________________ ABSTRACTAspergillus section Flavi comprises species with conidial heads from yellow-green to brown and dark sclerotia. The taxonomy of this group is complex and continually evolving. Two groups have been described in this section: The first consists of Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius, Aspergillus pseudotamarii, Aspergillus bombycis, Aspergillus parvisclerotigenus, Aspergillus arachidicola and Aspergillus minisclerotigenes, which are producers of aflatoxins, and the second comprises Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus tamarii and Aspergillus caelatus, which are aflatoxin non-producing species. Aflatoxins are toxic secondary metabolites produced by aspergilli when under favorable moisture and temperature conditions. Contamination of Brazil nuts is mainly by fungi that produce aflatoxins, primarily by species within Aspergillus section Flavi. A. oryzae is an economically important fungus used in a wide range of technological applications on industrial scales. Its main applications comprise the preparation of fermented food products and the production of hydrolytic enzymes that act in the conversion of agro-industrial residues, such as sugar cane bagasse, into fermentable sugars for the production of second generation biofuel. At the molecular level, A. oryzae is classified next to A. flavus. The aims of this study are to develop a molecular diagnostic method for aflatoxigenic member species of Aspergillus section Flavi, to investigate the nucleotide diversity in aflatoxin biosynthetic pathway genes in A. flavus strains contrasting in aflatoxin production, and to characterize the transcriptome of A. oryzae BLU37, a promising fungal strain for the production of lignocellulolytic enzymes. Fungal isolates were collected from contaminated Brazil nut, cashew and peanut materials across a number of states in Brazil. Isolates belonging to the genus Aspergillus were identified through morphological examination. Molecular-based identification was conducted by sequence analysis of rDNA ITS regions. A molecular-based method for specific identification of aflatoxin-producing members of the Aspergillus section Flavi which occur in contaminated nuts in Brazil was developed through restriction digestion of mtDNA SSU rDNA region amplicons. A total of 80 isolates of A. flavus from Brazil nut and cashew nut were characterized for aflatoxin production when exposed to environmental conditions that induce the production of aflatoxin. These strains were cultured for seven days at 28°C in semi-solid culture medium YES, water activity 0.99 and analyzed by HPLC - FLD. Thirteen overlapping primers pairs were designed for complete coverage of aflatoxin biosynthesis genes in A. flavus, namely the transcription factor aflR, and the genes aflP and aflQ, which code for enzymes involved in conversion of aflatoxin precursors. For a total of 13 aflatoxin producing and 13 non-producing isolates, previously characterized for aflatoxin production by TLC, the aflR gene was partially sequenced. Sequence editing, alignment and SNP polymorphism identification was conducted using Sequencher v4.8 program (Gene Codes Corporation). Intraspecific nucleotide diversity based on SNP frequency was used for defining haplotypes and linkage disequilibrium with the program Tassel. Understanding of nucleotide diversity between A. flavus aflatoxin producers and non-producers is important for development of a molecular diagnostic system for application in appropriate strategies for mycotoxin prevention and control. Transcriptome analysis of A. oryzae strain BLU37 was examined from in-vitro cultures grown on different carbon sources. A. oryzae spore suspensions at a final concentration of 1 x 1010 sporos/mL were used to inoculate semi-solid and liquid media cultures containing a minimal medium plus specific carbon source [glucose 0.5% (w/v); pre-treated sugarcane bagasse (pH 7.0) 0,5% (w/v)]. Cultures were incubated at 28°C over a time-course of 36 h and 48 h, totaling eight distinct treatments, each carried out in duplicate. Following total RNA isolation from harvested fungal mycelia, messenger RNA isolation, full-length enriched cDNA library preparation and Illumina RNAseq (www.Illumina.com) was carried out in collaboration with Eurofins MWG Operon (Alabama, USA). Quality-trimmed reads were mapped to the A. oryzae RIB40 genome (National Research Institute of Brewing Stock Culture ATCC-42149). A total of 68.67 Gbases of qualitytrimmed sequence data was generated from 16 sequenced cDNA libraries, with an average of 50.2 million reads per library and a mean read length of 80.34 bp. The CarbohydrateActive Enzyme database (CAZy - http://www.cazy.org/) was employed in order to identify all glycoside hydrolases (GHs), glycosyl transferases (GT), polysaccharide lyases (PLs), carbohydrate esterases (CEs) and Carbohydrate-Binding Modules (CBM) expressed by A. oryzae under growth condition treatments. A total of 202 genes belonging to CAZy families were found. The Fungal Transcription Factor Database (http://ftfd.snu.ac.kr/index.php?a=view), identified 44 genes belonging to 5 transcription factor families. This study will contribute to understand the complexity of the A. oryzae BLU37 transcriptome, an importance fungus for production of enzymes that have a wide range of technological applications, particularly in development of second generation biofuels from agroindustrial wastes