Somatic embryogenesis of coffee (Coffea arabica l.) and histological and biochemical analysis of the different stages involved in the process

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2012.A cafeicultura é uma atividade de grande expressão no cenário agroindustrial brasileiro, colocando o Brasil como o maior produtor e maior exportador de café do mundo. Coffea arabica L. (Rubiaceae) é responsável por 70% de todo o café produzido e comercializado no mundo. O sucesso dos programas de melhoramento genético do cafeeiro tem disponibilizado variedades mais adaptadas. Entretanto a propagação convencional do cafeeiro é muito lenta. Dessa forma, a propagação clonal da espécie é fundamental para possibilitar uma rápida difusão de novos genótipos de interesse. Sendo assim, a micropropagação via embriogênese somática é a melhor opção para a rápida propagação clonal em larga escala dessa espécie. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi otimizar as estratégias de clonagem via embriogênese somática indireta a partir de folhas jovens do cafeeiro (Coffea arabica L. variedade Catuaí Vermelho), além de compreender as principais etapas do processo, com o auxílio de cortes anatômicos e análises bioquímicas. Na fase de indução de calo, foi avaliada a influência de genótipos de Coffea arabica (Catuaí Vermelho, Mundo Novo, Híbrido 427-2, Híbrido Clone 12), associados a tipos de folhas fenotipicamente semelhantes; a influência do número de explantes por placa de Petri (4, 6, 8 e 10) e tipos de folhas fenotipicamente semelhantes; o efeito de concentrações de sacarose (1, 2, 3 e 4%); as combinações de caseína hidrolisada (0 e 100 mg.L-1) e extrato de malte (0 e 400 mg.L-1); o efeito de tipos de auxinas (2,4-D e Picloram) e suas concetrações (2,5; 5; 10 e 20 μM) para as variedades Catuaí Vermelho e Mundo Novo, além da citocinina 2-iP (5, 10, 20 e 30 μM). Na fase de multiplicação, foi analisada a influência da densidade inicial de calos embriogênicos (6, 8, 10 e 12 g.L-1); volumes de Erlenmeyers (125 e 250 ml), associados ao ajuste ou não da densidade, bem como a presença e ausência de luz. Experimentos também foram efetuados na fase de regeneração, maturação e germinação de embriões, onde foram testados o número de calos embriogênicos por placa de Petri (4, 6, 8 e 10), o efeito da luz e escuro, associado ao tempo de cultivo (30, 60 e 90 dias), além do efeito da luz e escuro associado a diferentes densidades iniciais de células (1, 5 e 10 g.L-1). Para melhor entender o processo embriogênico, cortes anatômicos seriados foram realizados em explantes foliares com diferentes períodos de cultivo nos meios primário e secundário (0, 4, 7, 15, 30 dias), calo primário tipo 1, calo primário tipo 2, calo embriogênico, embriões globulares, embriões torpedo, embriões cotiledonares e embriões zigóticos. Por fim, foram extraídos e quantificados os carboidratos, os aminoácidos e as proteínas de diversas fases do desenvolvimento embriogênico. Verificou-se que a variedade Catuaí Vermelho é a que melhor responde ao protocolo de indução de calo. A amostragem de folhas e a percentagem de formação de calo primário tipo 2 influenciam a percentagem de formação de calo embriogênico. A utilização de seis explantes por placa, a concentração de 3% de sacarose, a utilização de caseína hidrolisada associada ao extrato de malte e a concentração de 10 μM de 2-iP proporcionam os melhores resultados para a formação de calo embriogênico. Na fase de multiplicação, o tratamento com densidade inicial de 10 g.L-1 de calo embriogênico, o uso do frasco de 250 ml de capacidade, com ajuste parcial da densidade e material cultivado na ausência de luz responderam com as melhores taxas de multiplicação de calo embriogênico. A etapa de regeneração, maturação e germinação de embriões somáticos foi otimizada com a inoculação de quatro ou seis explantes por placa, cultivados por 90 dias em meio de regeneração e, quando transferidos para o meio de germinação líquido, a densidade inicial de 5 g.L-1 proporcionou a maior sincronização na maturação dos embriões. Em relação à anatomia das diferentes etapas, foi verificado que a formação de calo primário acontece aos 7 dias de cultivo e esse calos se originaram a partir de divisões sucessivas de células do procâmbio. Calos primários tipo 1 e tipo 2 apresentaram morfologia e tipos celulares distintos e o calo embriogênico é originado do calo primário tipo 1. O metabolismo dos carboidratos, aminoácidos e proteínas auxiliam para uma melhor interpretação e entendimento sobre os processos de indução da embriogênese somática, assim como a regeneração, maturação e germinação dos embriões somáticos. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACTCoffee cultivation is a very important activity for Brazilian agroindustry, positioning Brazil as the largest producer and exporter of coffee in the world. Coffea arabica L. (Rubiaceae) is responsible for seventy percent of all the coffee produced and sold worldwide. The success of programs for the genetic improvement of coffee has resulted in the availability of better-adapted varieties. However, conventional propagation of the coffee plant is very slow. Thus, clonal propagation of the species is fundamental to enable rapid proliferation of new genotypes of interest. Micropropagation via somatic embryogenesis is the best option for rapid, large-scale clonal propagation of this species. In this context, this work aimed to optimize cloning strategies via indirect somatic embryogenesis, using young leaves of coffee plants (Coffea arabica L. variety Catuaí Vermelho), and to understand the key steps in the process, with the aid of anatomical sections and biochemical analyses. In the callus induction phase, we evaluated the influence of genotypes of Coffea arabica (Catuaí Vermelho, Mundo Novo, Híbrido 427-2, Híbrido Clone 12), associated with phenotypically similar leaf types; the influence of the number of explants per Petri dish (4, 6, 8, and 10) and phenotypically similar leaf types; the effect of sucrose concentrations (1, 2, 3, and 4%); combinations of hydrolyzed casein (0 and 100 mg/L) and malt extract (0 and 400 mg/L); the effect of auxin types (2,4-D and Picloram) and their concentrations (2.5, 5, 10, and 20μM) for the Catuaí Vermelho and Mundo Novo varieties, as well as cytokinin 2-iP (5, 10, 20, and 30μM). In the multiplication phase, we analyzed the influence of the initial density of the embryogenic calli (6, 8, 10, and 12 g/L); the volumes of the Erlenmeyer flasks (125 and 250 ml), associated with the adjustment or non-adjustment of density, as well as the presence or absence of light. Experiments were also conducted in the regeneration, maturation, and embryo-germination phase to test the number of embryogenic calli per Petri dish (4, 6. 8, 10), the effect of light and dark associated with cultivation time (30, 60, and 90 days), in addition to the effect of light and dark associated with the different initial densities of the cells (1, 5, and 10 g/L). In order to gain a better understanding of the embryogenic process, series of anatomical sections were prepared from foliar explants at different stages of growth in primary and secondary media (0, 4, 7, 15, and 30 days): primary callus type 1, primary callus type 2, embryogenic callus, globular embryos, torpedo embryos, cotyledonary embryos, and zygotic embryos. Finally, carbohydrates, amino acids, and proteins from various phases of embryogenic development were extracted and quantified. It was found that the Catuaí Vermelho variety was the one that best responded to the callus induction protocol. The leaf sample and the percentage of primary callus type 2 influenced the formation of embryogenic callus. The use of six explants per dish, a concentration of 3% of sucrose, hydrolyzed casein in combination with malt extract, and a concentration of 10 μM of 2-iP provide the best results for embryogenic callus formation. In the multiplication phase, treatment with an initial density of 10 g/L of embryogenic callus, the use of a 250 ml capacity flask, with partial adjustment of density, and material cultivated in the absence of light led to the highest rates of multiplication of embryogenic callus. The regeneration, maturation, and germination phase of somatic embryos was optimized with the inoculation of four or six explants per petri dish, cultivated for 90 days in regeneration medium and, when transferred to liquid germination medium, an initial density of 5 g/L yielded the highest synchronization in the maturation of the embryos. In relation to the anatomy of the different stages, it was found that the formation of primary callus occurs at seven days of cultivation, and that these calli originate from the successive division of procambium cells. Primary calli type 1 and type 2 have distinct morphology and distinct cell types, and the embryogenic callus originates from type 1 primary callus. The metabolism of carbohydrates, amino acids, and proteins enables a better interpretation and understanding of the induction processes of somatic embryogenesis, and of the regeneration, maturation, and germination of somatic embryos