Embriogênese somática e análises morfoanatômicas e por citometria de fluxo em açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Florestal, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, 2014.O presente trabalho objetivou desenvolver e otimizar o protocolo de embriogênese somática em açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.), a partir do uso de propágulos formados por embriões zigóticos (EZ) oriundos de sementes em diferentes estádios de maturação, além de folhas e inflorescências imaturas provenientes de plantas adultas. Adicionalmente, análises morfo-anatômicas e por citometria de fluxo foram realizadas para melhor caracterizar e entender as etapas do processo. Na primeira parte deste trabalho, a embriogênese somática em EZ maduros e imaturos foi obtida, inicialmente a partir da indução de calos embriogênicos em meio de Murashige e Skoog (MS), suplementado com 2,5 g.L-1 de carvão ativado e com a auxina picloram nas concentrações de 225 e 450 μM. Uma vez obtidos, calos embriogênicos com embriões somáticos em início de diferenciação foram transferidos para meio de cultura com 12,3 μM de 2iP e 0,6 μM de ANA, visando a diferenciação e maturação de embriões somáticos. A regeneração de plantas foi realizada em meio de cultura com 1,0 μM BAP e 0,5 μM AG3. Em meio de indução foi possível observar a formação de calos embriogênicos em todos os tratamentos, independentemente do estádio de desenvolvimento dos EZ testados. O picloram na concentração de 450 μM proporcionou os melhores resultados para a formação de calos embriogênicos (84,7%). Na fase de diferenciação e maturação 100% dos explantes que apresentavam formação de calo embriogênico formaram embriões somáticos. A maior frequência de regeneração de plantas (58,7%) foi observada no tratamento em que se utilizou o meio de indução constituído por 450 μM de picloram e em embriões somáticos obtidos de explantes oriundos de EZ imaturos. A partir de análises morfoanatômicas comprovou-se que a indução da embriogênese somática apresentou estádios característicos do tipo indireto. As plantas regeneradas apresentaram desenvolvimento normal, com crescimento de raízes e parte aérea. Os calos, embriões somáticos e as plantas obtidas foram analisados por citometria de fluxo para verificar possíveis alterações no DNA, fato que não foi observado. A segunda parte deste trabalho utilizou explantes provenientes de inflorescências e folhas imaturas para a indução da embriogênese somática. Os explantes provenientes de plantas adultas, uma vez obtidos, foram colocados em meio de cultura de MS, suplementado com 2,5 g.L-1 de carvão ativado e as auxinas picloram e 2,4-D na concentração de 450 μM para a indução de calos. Foram testadas inflorescências imaturas em diferentes estádios de desenvolvimento (estádios I= 6 cm; II= 8 cm e III= 12 cm), e folhas imaturas de diferentes regiões foliares do palmito (basal, mediano e apical). Para a diferenciação de embriões somáticos, calos embriogênicos e embriões somáticos foram transferidos para meio de cultura com as concentrações de picloram e 2,4-D reduzidas para 0,1 mg.L-1. Embriões somáticos em início de diferenciação foram transferidos para meio de cultura com 12,3 μM de 2iP e 0,6 μM de ANA para a maturação de embriões somáticos. Verificou-se que a auxina picloram proporcionou os melhores resultados na indução de calos embriogênicos, tanto para inflorescências como para as folhas imaturas. Os diferentes estádios de desenvolvimento das inflorescências não apresentaram diferenças significativas nas respostas, enquanto que nas folhas imaturas resultados superiores na etapa de indução para a formação de calos foram observados quando os explantes eram provenientes das regiões basal e mediana do palmito. Na etapa de diferenciação, calos embriogênicos provenientes de inflorescências imaturas em meio de cultura com picloram apresentaram até 100% dos explantes diferenciando embriões somáticos, que progrediram lentamente para estádios de torpedo em meio de maturação. Já em calos embriogênicos provenientes de folhas imaturas a diferenciação de embriões somáticos foi observada somente em explantes cultivados originalmente em meio suplementado com picloram em porcentagens que atingiram até 50% dos explantes da região mediana do palmito, embora, esses embriões somáticos não tenham apresentado progressão para estádios mais tardios de desenvolvimento. Os resultados obtidos sugerem que tanto os explantes provenientes de inflorescências como de folhas imaturas podem ser utilizados como fontes de explantes para a embriogênese somática em açaizeiro.This study had the aim of developing and optimizing the protocol for somatic embryogenesis in açaí palm (Euterpe oleracea) using explants from zygotic embryos removed from seeds at different stages of maturation and from leaf and immature inflorescences from adult plants. Moreover, morphological, anatomical and citometry of flux analyses were achieved to a better characterization and comprehension of the process phases. At the first part of this work, somatic embryos (SE) were obtained from mature and immature zygotic embryos (ZE). Initially, embryogenic calli were induced on Murashige & Skoog (MS) medium supplemented with 2.5 g.L-1 of activated charcoal and the auxin picloram at the concentration of 225 or 450 μM. Once developed, embryogenic calli carrying SE at the begin of differentiation were transferred to culture medium containing 12.3 μM of 2iP and 0.6 μM of NAA, in order to induce the differentiation and maturation of the somatic embryos. Plant regeneration occurred at culture medium supplemented with 1.0 μM BAP and 0.5 μM GA3. At the induction medium, embryogenic calli were formed in all treatments, independently of the maturation state of the ZE used as explant, however, the medium with 450 μM picloram showed the best results for the formation of embryogenic calli (84.7%). At the differentiation and maturation phase, 100% of the explants containing embryogenic callus allowed the development of somatic embryos. The higher frequency of plant regeneration (58.7%) was obtained at the induction medium with 450 μM picloram and using the immature ZE explants. Through the morpho-anatomical analysis it could be proved that the induction of the somatic embryogenesis showed characteristics stages of the indirect development. The plants regenerated from the embryos showed a normal development, with a normal growing of roots and aerial part. At the end, the calli, SE and plants regenerated were analyzed by flow cytometry to quantify the amount of DNA, which showed no differences between the samples. At the second part of this work, explants from inflorescences and immature leaves were used to induce somatic embryogenesis. Those explants, from adult plants, were inoculated at culture medium MS supplemented with 2.5 g.L-1 of activated charcoal and two auxins, picloram or 2,4-D, at the concentration of 450 μM for the callus induction. Immature inflorescences at three developmental states (I = 6 cm; II = 8 cm and III = 12 cm) and immature leaves from different regions (basal, median and apical) of the heart of palm were tested. To the differentiation of the somatic embryos, embryogenic calli and SE were transferred to a culture medium containing the same original auxin, picloram or 2,4-D, with the concentration reduced to 0.1 mg.L-1. Somatic embryos at the beginning of differentiation were transferred to a culture medium containing 12.3 μM of 2iP and 0.6 μM of NAA for the maturation of the somatic embryos. The auxin picloram showed best results at embryogenic callus induction in both inflorescences and immature leaves. The inflorescences at different stage of development did not show significant differences at the end, while for the immature leaves, explants from the portions basal and median of the heart of palm gave rise to the best results at the induction of callus phase. At the differentiation phase, embryogenic calli from the immature inflorescences grown at medium containing picloram showed 100% of differentiation to somatic embryos, and these developed slowly to torpedo stage under the maturation medium. While considering the embryogenic calli from the immature leaves, the differentiation of somatic embryos occurred only on explants cultivated originally at medium supplemented with picloram, reaching the percentage of 50% for the explants from the median region, although, those somatic embryos did not developed to later stages of development. The results allow suggesting that explants from both immature inflorescences and leaves from adult plants of açaí palm can be used as explant sources to somatic embryogenesis