Marcação de células-tronco mesenquimais com nanopartículas metálicas funcionalizadas com ácido 2,3-Dimercaptosuccínico (DMSA)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014.Introdução: A marcação e o rastreamento de células-tronco in vivo são técnicas não invasivas que permitem visualizar o deslocamento das células dentro do organismo e o quanto efetivamente elas migram para locais patologicamente afetados, a fim de aperfeiçoar terapias celulares. Alguns materiais comumente usados como marcadores de células-tronco são nanopartículas metálicas; entretanto, sabe-se que estes componentes podem ser prejudiciais para as células receptoras, tornando-se importante a realização de estudos preliminares de biocompatibilidade antes de marcar e rastreá-las in vivo. Objetivo: Verificar se nanopartículas de óxido de ferro e de ouro, ambas funcionalizadas com ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA), podem atuar como traçadores para células-tronco mesenquimais de polpa dental (pdCTMs), sem afetar sua fisiologia e, ao mesmo tempo, permitindo a visualização e rastreamento destas por microtomografia computadorizada em um modelo murino de fibrose pulmonar. Métodos: a) A toxicidade de ambas as nanopartículas sobre as pdCTMs foi avaliada através de ensaios de viabilidade celular com MTT e Azul de Tripan; das análises morfológicas das células marcadas em microscopia de luz; e da análise em microscopia eletrônica de transmissão (MET). b) A visualização e mensuração da interiorização das nanopartículas Fe-DMSA foi realizada por meio da técnica de coloração "Azul da Prússia" e pela dosagem colorimétrica deste corante, respectivamente. A visualização e quantificação do uptake das nanopartículas Au-DMSA foi realizada por análise em microscopia confocal e por espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES), respectivamente. c) Verificou-se se houve alterações de parâmetros fisiológicos como: diferenciação osteogênica e adipogênica; taxas de proliferação; e supressão linfocitária nas pdCTMs marcadas com as nanopartículas. d) Empregou-se o modelo murino de fibrose pulmonar, induzida por bleomicina, para dar suporte teórico sobre a migração das pdCTMs marcadas quando inoculadas por duas vias de administração: intravenosa e intranasal. e) Testou-se o uso da Fe-DMSA e da Au-DMSA como traçadores de pdCTMs, verificando a eficiência de detecção destas, em microtomografia computadorizada. Após a inoculação de 5x10? células marcadas em camundongos, estes foram analisados diariamente no equipamento. Resultados: Não houve redução estatisticamente significativa da viabilidade das pdCTMs e não foram detectados, em microscopia de luz, sinais característicos de morte celular na presença do Fe-DMSA e Au-DMSA, em todas as concentrações testadas. Fotos obtidas por MET comprovaram a presença destas nanopartículas no citoplasma celular: observou-se as Au-DMSA e as Fe-DMSA associadas a algumas organelas, principalmente mitocôndrias, provocando alterações ultraestruturais nestas. Assim, estas imagens sugerem toxicidade mitocondrial e formação de corpos apoptóticos, principalmente nas pdCTMs expostas ao Fe-DMSA. Os testes de mensuração de interiorização indicaram uma quantidade média de 17 picogramas (pg) de Fe-DMSA em cada célula e4pg de Au-DMSA/célula. Também não houve alterações significativas das taxas de adipogênese e osteogênese; das curvas de crescimento e da inibição de proliferação linfocitária entre pdCTMs marcadas e nãomarcadas. Apesar da biocompatibilidade entre as nanopartículas e as células, tanto o Au- DMSA quanto o Fe-DMSA não puderam ser detectados no microtomógrafo, após serem incorporados pelas pdCTMs. Conclusões: Embora assegurado, em termos de biocompatibilidade, o uso de Fe-DMSA e Au-DMSA como marcadores de pdCTMs, estas nanopartículas metálicas mostraram não ser adequadas para visualização e rastreamento in vivo das células por microtomografia, tendo em vista que não foram detectadas pelo equipamento, nas concentrações testadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTIntroduction: Labeling and Tracking stem cells in vivo are noninvasive techniques that allow visualizing the movement of cells within the body and how effectively they migrate to pathologically affected sites, in order to improve cellular therapies. Some materials commonly used as stem cells markers are metallic nanoparticles; however, it is known that these components can be prejudicial to receptor cells, hence it is important to perform preliminary biocompatibility studies before label and track them in vivo. Objective: Assess if iron oxide and gold nanoparticles, both functionalized with 2,3-dimercaptosuccinic (DMSA) acid, can act as tracers for mesenchymal stem cells from dental pulp (dpMSCs), without affecting their physiology and, at the same time, allowing the visualization and tracking of these in a computed microtomography apparatus, based on an experimental model of pulmonary fibrosis. Methodology: a) The toxicity of both nanoparticles on dpMSCs was assessed by MTT and Trypan Blue viability assays; by morphological analysis of labeled cells under light microscopy; and by analysis in transmission electron microscopy (TEM). b) The visualization and measurement of nanoparticles Fe-DMSA uptake were performed by "Prussian Blue" staining technique and by colorimetric dosage of this dye, respectively. Visualization and uptake quantification of Au-DMSA nanoparticles were performed by confocal microscopy and analysis by optical emission spectrometry with inductively coupled plasma (ICP-OES), respectively. c) Changes in physiological parameters, such as osteogenic and adipogenic differentiation; proliferation rates; and lymphocyte suppression, were checked in labeled dpMSCs. d) A murine model of pulmonary fibrosis, induced by bleomycin, was employed to give theoretical support about the labeled dpMSCs’ migration when inoculated by two routes of administration: intravenous and intranasal. e) After inoculation of 5x10 ⁵ labeled cells in mice, these were analyzed daily in the microtomograph in order to detect uptaken Fe-DMSA and Au-DMSA, checking their efficiency as tracers of dpMSCs. Results: There was no statistically significant reduction in the dpMSCs viability and characteristic signs of cell death were not detected by light microscopy analysis, after Fe-DMSA and Au-DMSA uptake, at all concentrations tested. Photos obtained by TEM confirmed the presence of these nanoparticles in the cytoplasm: Fe-DMSA and Au-DMSA were observed associated to some organelles, especially mitochondria, causing structural changes there. Hence mitochondrial toxicity and formation of apoptotic bodies was observed, especially in dpMSCs exposed to Fe DMSA. The uptake measurement tests indicated an average amount of 17 picograms (pg) of Fe-DMSA per cell and 4 pg of Au-DMSA per cell. There were also no significant changes in adipogenesis and osteogenesis; growth curves and inhibition of lymphocyte proliferation between labeled and unlabeled dpMSCs. Although the biocompatibility between both nanoparticles and cells was proved, Fe-DMSA as well as Au-DMSA could not be detected in microtomograph after being incorporated by dpMSCs. Conclusions: In terms of biocompatibility, the use of Fe-DMSA and Au-DMSA as tracers for dpMSCs was assured. However, these metal nanoparticles shown to be not suitable for visualization and tracking of these cells in vivo by computed microtomography, considering that they were not detected by the equipment, at the concentrations tested