Role of protein methyltransferases in the development and prognosis of childhood acute lymphoblastic leukemia

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014.As leucemias linfóides agudas (LLA) são o tipo mais comum de neoplasia maligna da infância, correspondendo a 25-30% de todos os cânceres nesse grupo e constituem um exemplo de sucesso terapêutico em oncologia pediátrica. Hoje, os mais eficazes centros de tratamento são capazes de gerar taxas de sobrevida global em 5 anos de cerca de 80-90% na população assistida. Apesar de várias características clínicas, citogenéticas e moleculares já serem sabidamente definidoras de prognóstico, marcadores mais robustos ainda necessitam ser descobertos, tendo em vista que, mesmo em países desenvolvidos, cerca de 20% das crianças com LLA ainda evoluirão ao óbito pela neoplasia. Uma das alterações citogenéticas mais conhecidas consiste nos rearranjos da região cromossômica 11q23 que fusionam o gene MLL com diversos outros genes localizados em outros cromossomos. A presença desses rearranjos, de maneira geral, sinalizam um pior prognóstico em LLA. Tendo em vista que a proteína Mll consiste em uma metiltransferase de lisina, com função já sabidamente alterada no contexto das LLAs, foi aventada a hipótese da existência de alterações de expressão gênica em outros genes codificadores de metiltransferases de proteínas nesse tipo de neoplasia. Foram comparadas, após estudo-piloto para seleção dos melhores genes candidatos, 83 amostras de medula óssea de crianças com LLA ao diagnóstico com 8 controles não neoplásicos do mesmo tecido. Verificou-se, através de PCR em tempo real, que 8 dos 22 genes investigados (SMYD2, SMYD5, SETD1B, SETD2, SETD3, SETD4, SETD8 e SETMAR) apresentavam hiperexpressão nas amostras leucêmicas. Além disso, as expressões aumentadas de SMYD2, SETD2, SETD4 e SETD8 relacionaram-se com um pior prognóstico na análise univariada. No modelo multivariado, o gene SMYD2 mantinha-se como fator prognóstico independente, juntamente com as variáveis idade e a presença de blastos no 29º dia de quimioterapia. Foi observado, ainda, que pacientes com hiperexpressão de SMYD2 ao diagnóstico, apresentavam redução progressiva desses níveis no 15º e 29º dias de quimioterapia. A hiperexpressão de SMYD2 ainda se correlacionou com idade e hiperleucocitose na coorte estudada, o que sugeriu um possível papel dessa metiltransferase no controle da proliferação celular. Através de experimento com siRNA e citometria de fluxo com CFSE, observou-se que a taxa de proliferação da linhagem Nalm6, derivada de LLA, sofreu redução significativa após silenciamento específico de SMYD2. Neste trabalho demonstrou-se, portanto, a existência de alteração da expressão de outros genes codificadores de metiltransferases de lisina em LLA da infância, além da já bem descrita para o gene MLL. Além disso, verificou-se que a expressão aumentada de alguns desses genes teve relação com pior prognóstico na coorte estudada. Finalmente, comprovou-se, em linhagem celular de leucemia, que o silenciamento do gene SMYD2 é capaz de reduzir a taxa de proliferação celular, o que pode ser causado por alterações da atividade de metiltransferase desse gene tanto ao nível de proteínas histonas quanto não-histonas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTAcute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhod malignancy, accounting for 25-30% of all cancers in this group and constitutes an example of successful treatment in pediatric oncology. Nowadays, the most effective treatment centers are able to generate 5-years overall survival rates between 80 and 90%. Although several clinical, cytogenetic and molecular characteristics are already known to defining prognosis, more robust markers still need to be discovered, given that, even in developed countries, about 20% of treated children still die because of ALL. One of these alterations are rearrangements of chromosome region 11q23 that fuses the MLL gene with several other genes located in other chromosomes. The presence of these rearrangements, in general, indicates a worse prognosis in ALL. Given that MLL protein consists of a lysine methyltransferase with altered function in ALL we hypothesized the existence of gene expression alterations in other lysine methyltransferases encoding genes in this type of neoplasm. After a pilot-study for selection of the best candidate genes, we compared 83 bone marrow samples from children with ALL at diagnosis with 8 nonneoplastic controls. It was found, by real-time PCR, that 8 of the 22 investigated genes (SMYD2, SMYD5, SETD1B, SETD2, SETD3, SETD4, SETD8 and SETMAR) showed overexpression in leukemic samples. Furthermore, the increased expressions of SMYD2, SETD2, SET4 and SETD8 genes were related to a worse prognosis in the univariate analysis. In the multivariate model, SMYD2 gene remained as an independent prognostic factor, together with age and the presence of blasts on 29th day of chemotherapy. It was also observed that those patients who had SMYD2 overexpression at diagnosis, showed progressive reduction of these levels in 15th and 29th days of chemotherapy. The overexpression of SMYD2 gene was still correlated with age and hyperleukocytosis in our cohort, suggesting a possible role of this methyltransferase in the cell proliferation control. Through siRNA and CFSE flow cytometry experiments, it was observed that the proliferation rate of Nalm6 cell line was reduced after specific silencing of SMYD2. Therefore, it was demonstrated that other key lysine methyltransferases encoding genes are also abnormally expressed in childhood ALL, in addition to the already well described MLL gene. Furthermore, it was found that increased expression of some of these genes was correlated with a bad prognosis in our cohort. Finally, it has been found that the knockdown of SMYD2 gene is capable of reducing the rate of leucemia cell lines proliferation