Study of antitumor activity of plant and culture fluid fungi extracts in cell lineages of human prostate adenocarcinoma

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2014.O câncer de próstata é o tumor mais comum diagnosticado em homens. As opções terapêuticas incluem a prostatectomia, radioterapia e até mesmo a vigilância ativa, em estágio inicias. Para doença em estágio avançado é indicada terapia local definitiva combinada com radioterapia adjuvante e/ou terapia hormonal de privação androgênica, porém sua eficácia é limitada. Assim os produtos naturais têm um papel importante como fonte na busca de novos agentes antitumorais. A biodiversidade brasileira, destacando o bioma Cerrado por sua enorme variedade de espécies, vem se tornando alvo importante na busca de novas biomoléculas com potencial terapêutico. O presente estudo tem como objetivo investigar a existência de atividade citotóxica de extratos de plantas e extratos de fluido de cultivo de fungos em linhagens de células de adenocarcinoma de próstata humano. Sob cultivo de duas linhagens de adenocarcinoma de próstata humano LNCaP clone FGC (sensível a androgênios), e PC3 (resistente a androgênios), e de uma linhagem controle de queratinócitos humanos normais (HaCat), foram investigados 31 extratos obtidos de plantas e 11 extratos de fluido de cultivo de fungos. O ensaio de viabilidade celular foi utilizado para avaliar a citotoxicidade e a curva dose-resposta. Foi analisado o perfil de morte celular e alterações no ciclo celular por meio de citometria de fluxo, utilizando kit comercial de anexina V e iodeto de propídeo. Foi realizada microscopia eletrônica de transmissão (MET) com o intuito de confirmar morfologicamente o perfil de morte celular. A fim de identificar compostos presentes nos extratos utilizou-se cromatografia em camada delgada. Entre os 31 extratos analisados, 12 extratos de plantas e 3 extratos de fluido de cultivo de fungos apresentaram atividade citotóxica maior que 50% em linhagem de adenocarcinoma de próstata andrógeno sensível (LNCaP). Sete extratos de plantas e 2 de fluido de cultivo de fungos apresentaram resposta dose dependente e índice de seletividade maior para a célula LNCaP. Estes apresentaram tendência a apoptose inicial e tardia e 4 extratos apresentaram parada do ciclo celular na fase G0/G1 estatisticamente significativa. Na análise global do efeito citotóxico em LNCaP, considerando também os índices de seletividade, destacaram-se os extratos de: Pouteria ramiflora caule etanólico (E), Pouteria torta fruto E, Bauhinia rufa folha E, Sapindus saponaria fruto E e Alamanda blanchetii folha E. Na linhagem PC3, 10 extratos de plantas apresentaram inicialmente resposta citotóxica maior que 50%, porém apenas 3 apresentaram resposta dose dependente. Destacaram-se extratos de B. rufa e P. caimito, com repressão significativa do ciclo celular e indução expressiva de apoptose tardia. Foi possível obter imagens de MET apenas de células LNCaP tratadas com A. blanchetii fruto E e de células PC3 tratadas com A. blanchetti folha hexânico (H), que confirmaram os achados pela citometria. Os compostos acetato de lupeíla, friedelenol e acetato de α amirina foram identificados nos extratos Pouteria ramiflora caule E e Pouteria torta fruto E. Todos os extratos com atividade citotóxica identificados foram etanólicos ou hexânicos. Os extratos citotóxicos identificados possuem potencial como fonte natural de compostos ativos e estudos futuros são necessários para caracterização de sua atividade farmacológica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTProstate cancer is the most common cancer diagnosed in men. Therapeutic options include prostatectomy, radiation therapy and active surveillance for initial stage tumors. For advanced disease, definitive local therapy combined with adjuvant radiotherapy and / or androgen deprivation hormone therapy are indicated, but their effectiveness is limited, with high mortality. Due to limited therapeutic options, natural products have an important role as a source for discovery of new antineoplastic agents. Brazilian biodiversity, particularly the Cerrado biome and its huge variety of species, is becoming an increasingly important target for the search of new biomolecules with therapeutic potential. The present study aimed to investigate the existence of anti-proliferative activity of plant and fungi extracts in cell lineages of human prostate adenocarcinoma. Under cultivation of two human prostate adenocarcinoma cell lineages, LNCaP clone FGC (androgen-sensitive) and PC3 (androgen-resistant), and a control cell lineage of human keratinocytes (HaCaT), 31 extracts of plants and 11 extracts of culture fluid of fungi were investigated. Cell viability assay was used to assess the cytotoxicity and to determine the dose-response curves. Cell death profile and changes in cell cycle were analyzed by flow cytometry, using propidium iodide and annexin V commercial kits. Transmission electron microscopy was performed to confirm the morphological profile of cell death. Thin layer chromatography was used to identify compounds in selected extracts, which presented significant time- and dose-dependent activity. Among 31 analyzed extracts, 12 extracts of plants and three extracts of culture fluid of fungi showed cytotoxicity greater than 50% in LNCaP cell lineage. Seven plant extracts and 2 extracts of culture fluid of fungi were shown to have a dose-dependent cytotoxic effect, with higher selectivity for cancer cell lineage LNCaP. These extracts showed a tendency to induce early and late cellular apoptosis and 4 extracts exerted a statistically significant inhibitory effect on cell cycle. Upon global analysis of the cytotoxic effect on LNCaP, including the selectivity index, the following extracts showed the most featured effects: Pouteria ramiflora stem ethanolic (E), Pouteria torta fruit E, Bauhinia rufa sheet E, Sapindus saponaria fruit E and Alamanda blanchetii leaf E. In the androgen-resistant PC3 cell lineage, plant extracts showed a cytotoxic effect initially greater than 50%, but for only 3 extracts 10 this effect was dose-dependent. The most prominent effects were observed for extracts from B. rufa and P. caimito, which induced significant cell cycle arrest and late apoptosis. It was possible to obtain images of LNCaP cells treated only with A. blanchetii E, and PC3 cells treated with A. blanchetti sheet H, which confirmed the findings by flow cytometry. The compounds lupeyl acetate, friedelenol and α amyrin acetate were identified in extracts Pouteria ramiflora stem and Pouteria torta fruit E. All cytotoxic extracts identified were E or H. The cytotoxic plant extracts identified herein represent a potential natural source of active compounds. Future studies are needed to characterize their pharmacological activity