Development of microsatellite markers and expression analysis of genes involved in biotic stress response in musa acuminata genotype

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014.Cultivares comerciais de bananeira (Musa spp) são cultivados em muitos países de ambientes tropicais e subtropicais. A reprodução assexuada da espécie resultou em uma base genética restrita, sem resistência a pragas e doenças, tornando as estratégias de melhoramento convencional muito limitadas devido a esterilidade de muitos cultivares comerciais. As estratégias de melhoramento não-convencionais, como a transformação e seleção assistida por marcadores, oferecem uma abordagem alternativa para a introgressão de genes de resistência em cultivares comerciais. Genes de resistência (R) em plantas codificam receptores de proteínas que reconhecem assinaturas moleculares de efetores de patógenos de plantas, desencadeando mecanismos de defesa como a imunidade disparada por efetores (ETI). Essa resistência pode ser perdida durante a co-evolução do hospedeiro e patógeno, favorecendo a evolução das novas raças patogênicas. Neste contexto, o desenvolvimento contínuo de cultivares de plantas resistentes é necessária, a fim de acompanhar a evolução de patógenos. O objetivo geral deste estudo foi identificar genes potencialmente envolvidos em respostas a estresses bióticos, que servirão como fonte de recursos para análises de expressão diferencial durante a interação de Musa acuminata com o patógeno Mycosphaerella musicola e o desenvolvimento de marcadores SSR para busca de polimorfismos em genótipos de M. acuminata. Dessa forma, foram identificados 14 unigenes expressando proteínas NBS-LRR em tecidos foliares de Calcutta 4 e 25 em Cavendish Grande Naine, ambos infectados e nãoinfectados. O mapeamento desses unigenes com modelos que contêm o domínio NB-ARC no genoma de referência de M. acuminata ssp. malaccensis var. Pahang (DH Pahang) identificou 38 contigs unigenes mapeando a 40 modelos de genes completos em Calcutta 4 e 43 contigs unigenes mapeando em 40 modelos de genes em Cavendish Grande Naine. Foram desenvolvidos 156 marcadores icrossatélites para os genes alvo derivados de diferentes fontes: sequências de transcritoma de folhas da interação M. acuminata e M. musicola, mapeadas em sequências de clones de BAC de M . acuminata Calcutta 4 contendo análogos a genes de resistência NB-ARC (RGAs); Sequências do genoma completo de M. acuminata DH Pahang contendo domínios conservados NB-ARC e outros genes R; e transcritos da interação entre M. acuminata e M. musicola minerados para genes de defesa. Destes locos SSR identificados, 21 (13,46%) foram polimórficos, com alelos por loco variando de 2 a 4, e o conteúdo de informação de polimorfismo variando de 0,31 a 0,67. As análises de expressão de 51 genes alvo demonstraram que 19 obtiveram especificidade na reação de PCR em tempo real e que a maioria dos genes envolvidos em processos de defesa não foram modulados, com exceção do gene da corismato sintase e NAC. O gene NPR1 foi expresso apenas no cultivar suscetível e os RGAs 37, 43, M09A31, M09A21, B03A51 e B03A11 tiveram um aumento de expressão quando inoculados com o patógeno. Os RGAs 43 e RGA 37 mostraram indução significativa em M. acuminata Calcutta 4 quando inoculada com o patógeno e os RGAs 9330, 7100, 6160, M09A31 e M09A21 apresentaram regulação negativa em Calcutta 4. Esta análise foi consistente com a tendência aparente de caracterizações anteriores de genes R individuais já que alguns genes R são induzidos por uma variedade de estímulos, alguns exibem respostas muito específicas e outros parecem não ser responsivos ao patógeno. A caracterização contínua de genes envolvidos em respostas ao estresse biótico em M. acuminata durante a interação com M. musicola, bem como o desenvolvimento de marcadores moleculares, irá contribuir para o desenvolvimento de uma gestão eficaz da doença Sigatoka com base no melhoramento genético através da transformação de plantas ou seleção assistida por marcadores. ________________________________________________________________________ ABSTRACTCommercial banana cultivars (Musa spp.) are grown across numerous countries in different tropical and subtropical environments. Conventional breeding strategies are limited due to sterility in many commercial cultivars. Asexually-driven evolution has resulted in a restricted genetic base, lacking resistance to pests and disease. Non-conventional breeding strategies, such as transformation and marker-assisted selection, offer an alternative approach for introgression of resistance genes in commercial cultivars. Resistance (R) genes in plants encode protein receptors that recognize molecular signatures of effectors of plant pathogens, triggering defense mechanisms of effector-triggered immunity (ETI). Such resistance can be lost during host and pathogen co-evolution, favouring the more rapid evolution of new pathogenic races. In this context, the continuous development of resistant plant cultivars is required in order to accompany pathogen evolution. The objective of this work was to identify genes potentially involved in responses to biotic stresses, which will serve as a resource for the design of specific primers for differential expression analysis during the interaction of M. acuminata with the pathogen Mycosphaerella musicola and development of SSR markers to search for polymorphisms in M. acuminata genotypes. From this, 14 expressed NBS-LRR R genes from Calcutta 4 and 25 in Cavendish Grande Naine. A total of 156 microsatellite markers were developed for genes potentially involved in resistance and defense responses, derived from different sources: 454-pyrosequencing derived leaf transcriptome sequences derived from the M. acuminata x M. musicola interaction, which mapped to BAC clone sequences from M. acuminata Calcutta 4 containing NB-ARC resistance gene analogs (RGAs); M. acuminata DH Pahang whole genome sequence regions containing conserved domains belonging to NB-ARC and other R genes; and 454-pyrosequencing transcripts from the M. acuminata x M. musicola interaction, enriched for defense genes. Among SSR loci evaluated, 21 (13.46%) were polymorphic, with alleles per locus ranging from 2 to 4, and polymorphism information content ranging from 0,31 to 0,67. The expression analysis of 51 target genes showed that 19 had specificity in real time PCR reaction and that most of the genes involved in defense processes were not modulated, with the exception of NAC and chorismate synthase gene. The NPR1 gene was expressed only in the susceptible cultivar and RGA 37, 43, M09A31, M09A21, B03A51 and B03A11 had increased expression when inoculated with the pathogen. The RGAs 43 and 37 showed significant induction in M. acuminata Calcutta 4 when inoculated with the pathogen and the RGAs 9330, 7100, 6160, M09A31 and M09A21 showed downregulation in Calcutta 4. This analysis was consistent with the apparent trend of previous individual genes R characterizations since some genes are induced by a variety of stimuli, exhibit some very specific responses and others seem to be responsive to the pathogen. The continued characterization of genes involved in response to biotic stress in M. acuminata during interaction with M. musicola, as well as the development of molecular markers, will contribute to the development of effective management of Sigatoka disease based on genetic improvement through plant transformation or marker assisted selection