Produção, caracterização e aplicação biotecnológica de pectinases produzidas pelo fungo Aspergillus oryzae cultivado em casca de maracujá-amarelo

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Molecular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014.CAPÍTULO 1 - Como consequência da produção significativa de suco, as cascas, como um dos principais resíduos, tem se tornado um problema ambiental e para isso tem sido necessário determinar formas viáveis para transformá-las em produtos úteis ou de dispor adequadamente delas buscando um impacto ambiental positivo e um interesse econômico. O trabalho objetivou produzir, purificar parcialmente e caracterizar pectinases secretadas pelo fungo Aspergillus oryzae quando crescido em casca de maracujá-amarelo como única fonte de carbono por 10 dias a 28°C em agitação constante (120 rpm). Após ultrafiltração com membrana de 10 kDa, o concentrado foi avaliado na sua capacidade de reduzir a viscosidade do suco de goiaba e no processo de biopurga têxtil, obtendo resultados satisfatórios. Posteriores etapas cromatográficas, filtração em gel (Sephacryl S-200) e troca iônica (HiTrap Q FF.), purificaram parcialmente uma pectinase, PEC-P1, a qual foi caracterizada quanto ao melhor pH e temperatura, efeito de íons e compostos fenólicos, especificidade pelo substrato, termoestabilidade e análises de gel de eletroforese SDS-PAGE e zimograma. Além disso, a enzima foi testada quanto a sua capacidade de reduzir a viscosidade do suco, obtendo resultados insatisfatórios. A PEC-P1 apresentou maior atividade no pH 4,5 e nas temperaturas de 55°C, 70°C e 75ºC. Os íons Ag+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ca2+ e Hg2+ e o EDTA tiveram efeito negativo, em diferentes porcentagens, e o íon Cu2 ativou a atividade enzimática. A PEC-P1 foi ativada pelo ácido ferúlico, cinâmico e 4-hidroxibenzoico e inibida por ácido tânico e a vanilina. No gel sob condições desnaturantes do extrato bruto, do concentrado e da PEC-P1 foram detectadas duas bandas de proteína de aproximadamente 43 e 45 kDa, coincidente com a coloração para atividade de pectinase. A meia vida a 50°C foi de 1440 minutos. Este trabalho se apresenta como o primeiro registro da produção de pectinases pelo fungo A. oryzae crescido em casca de maracujá-amarelo como fonte de carbono em meio liquido.CAPÍTULO 2 - Uma pectinase extracelular foi parcialmente purificada a partir de amostras de extrato bruto do fungo mesófilo A. oryzae quando cultivado em casca de maracujá-amarelo como fonte de carbono. A análise bromatológica determinou que casca de maracujá é particularmente rica em hemicelulose, seguido por lignina e celulose. O perfil de indução mostrou que a atividade pectinolítica aumentou de forma constante atingindo um valor elevado no décimo dia de crescimento. A pectinase (PEC-P1) foi parcialmente purificada por ultrafiltração e cromatografias de filtração em gel (Sephacryl S-200) e de troca iônica (HiTrap Q FF). A eletroforese sob condições desnaturantes do extrato bruto, do concentrado e da PEC-P1 mostrou duas bandas de proteína de aproximadamente 43 e 45 kDa, coincidente com as bandas de atividade de pectinases detectadas através do zimograma. A PEC-P1 apresentou maior atividade em pH 4,5 e a 55°C, 70°C e 75ºC. A atividade enzimática foi inibida por íons Ag+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ca2+ e Hg2+, EDTA e compostos fenólicos, ácido tânico e vanilina. A enzima foi ativada pelo íon Cu2+ e por compostos fenólicos, ácido ferúlico, cinâmico e 4-hidroxibenzoico. O concentrado diminuiu a viscosidade do suco de goiaba em 4,15%CAPÍTULO 3 - Uma amostra concentrada de pectinase, isolada do extrato bruto proveniente do cultivo do fungo A. oryzae em casca de maracujá-amarelo como fonte de carbono, foi testada no processo de biopurga da indústria têxtil. As avaliações da intensidade colorística (K/S), da umectabilidade do tecido e as imagens por MEV mostraram que a pectinase de A. oryzae foi mais eficaz do que a enzima comercial Viscozyme® L e menos eficaz do que a purga alcalina e uma amostra comercial de pectatos lyase (Quimilase® HPS). A análise por microscopia eletrônica de varredura após tratamentos enzimáticos e alcalino mostrou que a amostra de pectinase de A. oryzae foi responsável por poucas alterações da fibra de algodão.CAPÍTULO 4 - Pectinases produzidas pelo fungo A. oryzae crescido em meio líquido contendo casca de maracujá-amarelo como fonte de carbono foram extraídas utilizando um sistema micelar de duas fases aquosas contendo tampão fosfato de sódio/Triton® X-114. A condição mais adequada para esta extração foi avaliada em um desenho fatorial experimental 23 com três repetições no ponto central. A variável analisada foi a atividade pectinolítica a qual variou desde 0,233 a 0,601 UI/mL. A maior atividade foi obtida na fase pobre em micelas nas condições de 25ºC, 8% (p/p) de Triton® X-114 e 20% (p/p) do concentrado. Os resultados indicam que este sistema micelar de duas fases aquosas (SMDFA) foi capaz de remover pigmentos visíveis e possíveis inibidores de pectinase presentes no caldo de fermentação, ficando retidos na fase rica em micelas. Portanto, este sistema pode ser explorado como um primeiro passo na purificação de pectinases a partir de um sistema de produção de baixo custo, com potencial aplicação industrial. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACTCAPÍTULO 1 - As a result of significant production of juice, peels, as a major waste has become an environmental problem and it has been necessary to determine feasible ways to turn them into useful products or dispose of them properly seeking a positive environmental impact and an economic interest. The study aimed to produce, purify and partially characterize pectinases secreted by the fungus Aspergillus oryzae when grown in yellow passion fruit peel as the sole carbon source for 10 days at 28°C under constant agitation (120 rpm). After 10 kDa ultrafiltration membrane, the concentrate was evaluated on its ability to reduce the viscosity of guava juice and biopurga textile process, obtaining satisfactory results. Subsequent chromatographic steps, gel filtration (Sephacryl S-200) and ion exchange (HiTrap Q FF.) Partially purified a pectinase, PEC-P1, which was characterized as the best pH and temperature, effect of ions and phenolic compounds, substrate specificity, thermostability and analysis of SDS-PAGE gel and zymogram. Furthermore, the enzyme was tested for its ability to reduce the viscosity of the juice obtained unsatisfactory results. The PEC-P1 showed greater activity in the pH 4.5 and at temperatures of 55°C, 70°C and 75°C. The Ag+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ca2+ and Hg2+ ions and EDTA had a negative effect, in different percentages, and Cu2+ ion activated enzyme activity. The PEC-P1 was activated by ferulic acid, cinnamic acid and 4-hydroxybenzoic acid and inhibited by tannic acid and vanillin. The gel under denaturing conditions of the crude extract, concentrate and PEC-P1 two protein bands of approximately 43 and 45 kDa, coincident with staining for pectinase activity were detected. The half-life at 50°C was 1440 minutes.CAPÍTULO 2 - An extracellular pectinase was isolated from samples of crude extract of A. oryzae mesophilic fungus when grown on yellow passion fruit peel as the carbon source. The bromatological determined that passion fruit peel was particularly rich in hemicellulose, followed by lignin and cellulose. The profile showed that induction of pectinolytic activity increased steadily reaching the highest value on the tenth day of growth. The pectinase (PEC-P1) was partially purified by ultrafiltration, gel filtration chromatography, gel filtration chromatography (Sephacryl S-200) and ion exchange (HiTrap Q FF). The gel under denaturing conditions of the crude extract, concentrate and PEC-P1 showed two protein bands of approximately 43 and 45 kDa, coincident with that staining for pectinase activity. PEC-P1 was more active at pH 4.5 and 55°C, 70°C and 75°C. The enzyme activity was inhibited by some ions (Ag+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ca2+, Hg2+), EDTA and phenolic compounds (tannic acid and vanillin). The enzyme was activated by Cu2+ ion and phenolic compounds (ferulic acid, cinnamic acid and 4-hydroxybenzoic). The viscosity of guava juice was decreased by 4.15% when incubated with the concentrate sample.CAPÍTULO 3 - A concentrated pectinase, isolated from crude extract samples of the mesophilic fungus Aspergillus oryzae grown on passion fruit peel as the carbon source, was tested in the process of biopurga of the textile industry. The evaluations of coloristic intensity evaluation (K/S), the wettability of the fabric and the SEM images showed that the pectinase from A. oryzae was more effective than the commercial enzyme Viscozyme® L and less effective than commercial alkaline pectate lyase preparation (Quimilase® HPS) and alkaline purge. The analysis of scanning electron microscopy studies after enzymatic and alkali treatments showed that the pectinase sample of A. oryzae was responsible for few changes in the surface of the cotton fibers.CAPÍTULO 4 - Production of pectinase by the A. oryzae fungus grown in liquid medium containing yellow passion peel fruit like a carbon source were extracted by a micellar system of sodium phosphate buffer/Triton® X- 114. The most appropriate condition for this extraction was evaluated in an experimental factorial design 23 and three repetitions at the central point. The variable analyzed was pectinolytic activity with values between 0.233 and 0.601 IU/mL. The highest activity was obtained with the micelles poor phase under conditions of 25°C, 8% (wt/wt) Triton® X-114 and 20% (wt/wt) of the concentrate. The results indicated that this aqueous two-phase micellar system (ATPMS) was able to remove visible pigments and possible pectinase inhibitors presents in fermented broth, this compounds were captured in the micelas rich phases. Therefore, this system can be exploited like a first step in pectinase purification from a low cost production system with potential industrial application