Caracterização do efeito antifúngico de peptídeos presentes na peçonha de escorpiões em linhagens de Cryptococcus neoformans

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014.O crescente número de indivíduos imunocomprometidos levou ao aumentou da incidência de micoses sistêmicas. As infecções causadas pelo fungo Cryptococcus. neoformans são a maior causa de morte relacionada a fungos em pacientes com AIDS. Este cenário se agrava com o advento de linhagens resistentes a antifúngicos disponíveis bem como a alta toxicidade desses tratamentos aos pacientes. Dessa forma, a busca por novos fármacos mais eficientes e menos tóxicos é de grande urgência. Nesse sentido, o estudo de peptídeos antimicrobianos (AMPs) é promissor, uma vez que essas moléculas possuem como um dos principais alvos a membrana citoplasmática de patógenos de forma que esses organismos estão menos propensos a desenvolver resistência. AMPs são moléculas multifuncionais, apresentando tanto atividade microbicida como imunomodulatória. São peptídeos evolutivamente conservados em diversos grupos de seres vivos e produzidos em diversos tecidos. Nos animais peçonhentos, a produção de diversos AMPs tem sido descrita nas glândulas de peçonha, sendo portanto uma interessante fonte para buscas por novas moléculas microbicidas. Neste trabalho foi caracterizado o efeito antifúngico tanto de AMPs inéditos e AMPs de já descritos na literatura presentes na peçonha de escorpiões contra duas linhagens de C. neofomans. Dos 11 peptídeos testados, sete inibiram o crescimento de C. neoformans das linhagens H99 e B3501, porém nenhum peptídeo mostrou-se mais potente que a anfotericina B. A linhagem B3501 foi mais suscetível à ação de todos os peptídeos com atividade antifúngica comparada à linhagem H99. Observou-se também que a carga residual positiva dos AMPs identificados na peçonha de escorpião pode ser um importante parâmetro para a inibição do crescimento do fungo. Foi mostrado que as células fúngicas com a cápsula mais desenvolvida são mais suscetíveis à atividade inibitória dos AMPs, assim como células melanizadas também apresentam maior suscetibilidade em comparação ás células não melanizadas. É possível que a cápsula e a melanina exerçam um importante papel na atração eletrostática do peptídeo, resultando em uma maior suscetibilidade do fungo. Foi demonstrado também por meio de microscopia eletrônica de varredura que um dos peptídeos, denominado Peptídeo 6, foi capaz de causar danos na morfologia da célula. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe rising number of immunocompromised individuals is leading to an increase in the incidence of systemic mycoses. Infections caused by Cryptococcus neoformans are the major cause of death related to fungi in patients with AIDS. This scenario is aggravated by the advent of resistant strains to available antifungal agents and the high toxicity of these treatments to patients. Thus, the search for new more efficient and less toxic drugs is of great urgency. In this sense, the study of antimicrobial peptides (AMPs) is promising, since the main target of this molecules is the cytoplasmic membrane of pathogens, so these organisms are less likely to develop resistance. AMPs are multifunctional molecules with both microbicidal activity and immunomodulatory properties. These peptides are evolutionarily conserved in diverse groups of organisms and are expressed in various tissues. In venomous animals, the expression of several AMPs have been described in the venom glands and is therefore an interesting source in the search for new microbicide molecules. In this work, the effect of antifungal AMPs present in the venom of scorpions was characterized against two strains of C. neoformans. Seven peptides inhibited the growth of C. neoformans H99 and C. neoformans B3501, although, amphotericin B was more potent than any of the tested peptides. B3501 strain was more susceptible to the inhibitory activity of the tested AMPs than H99 strain. It was observed that the residual positive charge of the scorpion’s AMPs could be an important feature in their ability to induce fungal growth inhibition. It was also shown that yeast cells with larger capsule are more susceptible to the inhibitory activity of the tested AMPs. Fungal melanized cells also showed higher susceptibility compared to non-melanized cells. It is possible that the capsule and melanin play a role in electrostatic attraction of cationic peptide, enhancing the fungal susceptibility to these compounds. Scanning Electron Microscopy analysis revealed that one peptide, nominated Peptide 6, causes damage to cell morphology