Identificação e caracterização de peptídeos bioativos presentes na peçonha do escorpião Colombiano Centruroides margaritatus (Gervais, 1841)

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biología Celular Programa de Pós-graduação em Biología Molecular, 2014.Algumas toxinas isoladas da peçonha de escorpiões têm a capacidade de se ligar especificamente à superfície de células malignas, bactérias ou células excitáveis. Estes componentes, em alguns casos, têm se revelado capazes de inibir a progressão do câncer e da proliferação bacteriana, ou então de modificar a conformação de canais iônicos dependentes de voltagem presentes nas células excitáveis. Câncer, infecções microbianas e problemas neurológicos são objetos de preocupação em todo mundo, estimulando muitos cientistas a identificar e caracterizar novos agentes terapêuticos derivados de venenos e peçonhas animais. O objetivo do presente estudo foi realizar o isolamento e a caracterização preliminar de componentes citotóxicos, citolíticos e neurotóxicos presentes na peçonha do escorpião colombiano Centruroides margaritatus. Indivíduos adultos da espécie C. margaritatus foram coletados na Colômbia, na região do Vale do Patia. A peçonha, obtida por estimulação elétrica, foi liofilizada e armazenada a -20 °C, tendo sido, em seguida, fracionada por RP-HPLC em coluna C8. Linhagens de fibroblastos murinos normais (NIH3T3) e de células cancerosas MCF-7 (humana) e B16F10 (murina) foram utilizadas para avaliar os efeitos citotóxicos das diferentes frações cromatográficas empregando-se teste colorimétrico (MTT). Tais frações também foram avaliadas quanto à sua capacidade em inibir a proliferação de bactérias patogênicas. As frações biologicamente ativas foram analisadas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e algumas frações, mais homogêneas, foram purificadas por meio de RP-HPLC em coluna C18. Um novo peptídeo neurotóxico e antimicrobiano foi isolado e parcialmente caracterizado. Tal peptídeo, denominado F34, foi capaz de inibir a proliferação da bactéria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae com uma concentração inibitória mínima (MIC) de 64 μM. Análises da sequência N-terminal da toxina F34 revelaram uma estreita relação estrutural com a toxina Cn11, uma toxina modificadora de canais para sódio previamente isolada da peçonha do escorpião Centruroides noxius. Como a toxina F34 apresenta similaridade com outras toxinas moduladoras de canais iônicos, foram avaliados os efeitos dessa toxina sobre o potencial de ação de neurônios do gânglio dorsal de ratos (DRG). A toxina F34 (200 nM) promoveu um aumento na excitabilidade neuronal, causando despolarização da membrana e aumento na frequência de disparo de potenciais de ação. Durante a aplicação da toxina F34, injeções de pulsos hiperpolarizantes suficientes para repolarizar a membrana para os valores do potencial de repouso foram capazes de restaurar o comportamento normal de disparo dos potenciais de ação. Os efeitos da toxina F34 são reversíveis, assim como o disparo normal de potenciais de ação é recuperado após a retirada da toxina da preparação. Concluindo, o presente estudo produziu avanços na área de Toxinologia, uma vez que permitiu a identificação e caracterização parcial de uma série de peptídeos biologicamente ativos (neurotóxicos, citotóxicos e citolíticos) presentes na peçonha do escorpião Centruroides margaritatus, evidenciando a riqueza de componentes moleculares presentes nessa peçonha, bem como o potencial de tais toxinas como agentes terapêuticos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTSome toxins, isolated from scorpion venoms, have been reported to bind specifically to the surface of malignant cells, bacteria or excitable cells. These components have the ability to inhibit cancer and bacterial proliferation, or change the conformational arrangement of different subtypes of voltage-gated ion channels on excitable cells. Cancer, bacterial infections and neurological problems cause serious concerns around the world, and stimulate research and development of new therapeutic agents from animal poisons and venoms. The aim of the present study was to perform the isolation and preliminary characterization of neurotoxic, cytotoxic and cytolytic components presents in Centruroides margaritatus scorpion venom. Adult specimens of C. margaritatus were collected in Colombia, in the Patia Valley region. The venom, obtained by electrical stimulation, was lyophilized and stored at -20°C. Their components were purified using RP-HPLC in a C8 column. Normal fibroblasts (NH3T3) and cancer cells lineages (MCF-7 and B16F10) were used to evaluate the cytotoxic effects of the different chromatographic fractions using a colorimetric assay (MTT). These fractions were also tested against pathogenic bacteria to evaluate their capacity to inhibit cellular proliferation. The biologically active fractions were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry and some fractions, which exhibited a more homogenous profile, were submitted to RP-HPLC using a C18 column. One new neurotoxic and antimicrobial peptide was purified and partially characterized. This peptide, named F34, was able to completely inhibit the proliferation of K. pneumoniae with a MIC of 64 μM. Since F34 shares a significant similarity to Cn11, a Na+-channel blocking toxin previously isolated from the venom of the scorpion C. noxius, in their N-terminal sequence, the effects of F34 on the action potential in DRG neurons was tested. Bath application of F34 (200 nM) depolarized the neuron and induced multiple action potential firing. Application of the toxin also reduced the after-hyperpolarization which may explain the repetitive firing. At present we do not know if the decreased after-hyperpolarization is a direct action of the toxin or a consequence of the depolarization. During application of F34, injection of hyperpolarizing current sufficient to repolarize the membrane to its control resting potential restored normal firing. The effects of F34 were reversible as normal firing returned after washout of F34 from the bath. In conclusion, this study yielded advances in the Toxinology field, since it allowed the identification and partial characterization of a series of biologically active peptides (with neurotoxic, cytotoxic and cytolytic activities) present in the venom of the scorpion Centruroides margaritatus, showing the richness of molecular components present in this venom, and the potential of such toxins as therapeutic agents