Análise da diversidade genética de genes responsáveis pela infecção per os (pif) e de fatores associados à virulência de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2013.Os baculovírus são patogênicos a insetos e têm sido efetivos no controle de pragas em áreas agrícolas e florestais. No Brasil, o baculovírus anticarsia (AgMNPV) tem sido empregado como inseticida biológico desde o início da década de oitenta para o controle da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, uma das principais pragas dessa cultura. A principal rota de infecção do vírus se dá através da ingestão dos corpos de oclusão (OB) que, uma vez no intestino médio altamente alcalino, libera as partículas ODV (Occluded Derived Virus). A ligação, fusão e entrada dessas partículas nas células intestinais são mediadas por proteínas virais localizadas na membrana do ODV. Essas proteínas são codificadas por genes denominados pif (per os infectivity factors) os quais são fatores essenciais para infectividade oral, com consequente desenvolvimento da doença no corpo do inseto. Esse trabalho teve como objetivos: avaliar a estabilidade dos genes pif de isolados temporais e geográficos de AgMNPV; construir antissoros policlonais das proteínas PIF; construir vírus recombinantes com deleção de genes pif e analisar as sequências genômicas de dois clones de AgMNPV com grande diferença na virulência. Entre os genes pif dos isolados analisados, o gene pif2 apresentou ser o mais variável, possuindo maior número de sítios polimórficos entre os genes pif analisados. No entanto, a quantidade de SNP (Single Nucleotide Polymorphism) encontrada não indica alta variabilidade deste gene quando comparado a estudos semelhantes realizados com outros baculovírus. Este estudo revelou que apesar do vírus AgMNPV ter sido submetido a passagens subsequentes no inseto ao longo de 20 anos e da distância geográfica, os genes essenciais para a infectividade oral permaneceram estáveis. No estudo das proteínas PIF, somente a proteína PIF2 foi expressa, porém o anticorpo obtido não foi específico. Embora plasmídeos para deleção de genes pif tenham sido construídos, não foi possível a obtenção de vírus recombinantes. Os genomas dos clones virais analisados mostraram, entre outras características, a presença de uma única cópia dos genes pe38 e he65, que estão em duplicata no genoma do vírus AgMNPV-2D. Foi observado também que um dos clones virais (AgMNPV-16), com baixa virulência, possui muitas variações na região codificante do gene ie-2 e do gene pe-38. Esses genes são responsáveis pela transativação dos genes early que iniciam a replicação viral. Além disso, outros genes apresentaram alterações como odv-e56, que tem um papel essencial na maturação e envelopamento dos ODV, e os genes bro-a e bro-b que se encontram fundidos em uma única ORF. O número regiões hr também foi diferente entre os clones (Ag2D com nove, Ag-01 com oito e Ag-16 com sete hr). Os estudos de genes de infectividade oral e de fatores associados à virulência no hospedeiro são importantes para compreensão da dinâmica populacional do vírus em condições naturais e poder ser uteis no desenvolvimento de programas de controle biológico.Baculoviruses are pathogenic to insects and have been effective in controlling pests in agricultural and forestry areas. In Brazil, the baculovirus anticarsia (AgMNPV) has been used as a biological insecticide since the early eighties to control the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, a major pest of this crop. The main route of virus infection occurs through ingestion of occlusion bodies (OB) which once in the highly alkaline midgut, release ODV (Occluded Derived Virus) particles. The binding, fusion and entry of such particles into the intestinal cells are mediated by viral proteins located in the membrane of the ODV. These proteins are encoded by genes called pif (per os infectivity factors) which are essential for oral infectivity, with consequent development of the disease in the body of the insect. This study aimed to evaluate the stability of the pif genes of seasonal and geographic field isolates of AgMNPV; to express PIF proteins for construction of polyclonal antibodies; to construct recombinant viruses with deleted pif genes, and to analyze the genomic sequence of two AgMNPV clones with high difference on their virulence. Among the pif genes of the analyzed isolates the pif2 gene was the most variable among the genes studied, showing a higher number of polymorphic sites. However, the amount of SNP (Single Nucleotide Polymorphism) found does not indicate a high variability of this gene when compared to similar studies performed with other baculovirus. This study revealed that although the AgMNPV virus has been subjected to subsequent passages in insect for over 20 years and the geographic distance, the essential genes for oral infectivity remained stable. In the study of PIF proteins, only the PIF2 protein was expressed, but the obtained antibody was not specific. Although plasmids for pif gene deletion were constructed, the recombinant viruses with pif genes deletion have not been completed. The genomes of the viral clones analyzed showed the presence of a single copy of the pe38 and he65 genes which are in duplicate in the genome of the Ag-2D clone. Was observed that one of the viral clones (Ag-16), with lower virulence, has many variations in the ie-2 and pe-38 gene regions, which are responsible to transactivate early genes to start viral replication. Furthermore, other genes presented alterations like the odv-e56, and which have a essential role in the maturation and envelopment of the OD, and bro-a and bro-b genes that are in fused in only one ORF. The hr region number was also different among clones (Ag-2D with nine, Ag-01 with eight and Ag-16 with seven hrs). Studies on the per os infectivity factors genes and factors associated with virulence of the host are important to the understanding of the viral population dynamics in natural conditions and can be valuable in the development of biological control programs