Avaliação da citotoxicidade da terapia fotodinâmica mediada por nanoemulsão à base de óleo de açaí contra câncer de pele não-melanoma

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013.O câncer é definido como um conjunto de mais de cem doenças caracterizado por desordens celulares ocasionadas por múltiplas alterações genéticas que conduzem a um desequilíbrio na proliferação e morte celular. No Brasil, as estimativas para o ano de 2012 e 2013 apontam a ocorrência de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, dentre os quais, o mais incidente será o câncer de pele não melanoma. Devido a tantos efeitos colaterais das terapias convencionais no tratamento das neoplasias, a terapia fotodinâmica (TFD) desponta como uma alternativa segura e altamente eficaz no tratamento de diversos tipos de câncer. A sua alta eficácia decorre da indução direta de morte das células neoplásicas, da destruição da microvasculatura tumoral e do reforço da imunidade antitumoral. A TFD é realizada combinando-se o oxigênio molecular, luz de comprimento de onda específico e um fotossensibilizante. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma nanoemulsão (nanoA) à base de óleo de açaí como fotossensibilizante para uso na TFD e investigar os efeitos biológicos in vitro e in vivo no tratamento de câncer de pele não-melanoma. Para formulação da nanoA, foi utilizado água, óleo e surfactante Tween 80 e utilizou-se o método de temperatura de inversão de fase (PIT). Para a avaliação dos aspectos morfológicos e coloidais da nanoA utilizou-se recursos de microscopia eletrônica de transmissão e aparelho de dispersão dinâmica de luz Zetasizer, respectivamente. As propriedades fotofísicas foram avaliadas com leituras dos espectros de absorbância e fluorescência em espectrofotômetro. A nano A apresentou pico de absorção e emissão na região do vermelho,o que é bom para fotossensibilizantes a serem aplicados na TFD já que corresponde à janela óptica tecidual. O diâmetro hidrodinâmico obtido foi de 117,5 nm, o diâmetro médio de 74 nm, o índice de polidispersividade de 0,144 e potencial zeta de -0.536mV; características essas que viabilizam o uso da nanoA em sistemas biológicos devido a monodispersividade e pequeno diâmetro, favorecendo a retenção e permeação no tumor (EPR). A capacidade de geração de espécies reativas de oxigênio foi medida através do método de decaimento por benzofurano, comprovando a atividade fotoquímica do óleo, viabilizando seu uso como fotossensibilizante na TFD. A avaliação in vitro consistiu em análises de incorporação e distribuição da nanoA em células de carcinoma epidermóide humano A431 e em fibroblasto humano Detroit, assim como na avaliação da citotoxicidade das linhagens submetidas a diferentes concentrações da nanoA na ausência e na presença de luz. A linhagem normal mostrou-se inerte à incubação com a nanoA enquanto que a tumoral foi mais sensível nos menores tempos de exposição à nano tanto no escuro quanto pós-irradiação. O tempo necessário à incubação foi de quinze minutos e de irradiação equivalente à 10 minutos. A avaliação in vivo consistiu em análises clínica e histopatológica de tumores induzidos por injeção ortotópica de células A431 em camundongos nude, tratados com três sessões de TFD além de análises sanguíneas. Tanto a terapia quanto o fármaco sozinho apresentaram atividade antitumoral. A TFD foi responsável por 33% de regressão total enquanto que a nanoemulsão sozinha por 16% de regressão total e 33% de regressão parcial. Estes resultados indicam que esta inédita nanoemulsão é em potencial um novo fármaco para aplicação antitumoral, considerando a alta resistência do carcinoma estudado e a grande eficácia do tratamento alcançado. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTCancer is defined as a set of more than hundred diseases characterized by cellular disorders caused by multiple genetic alterations that leads to imbalance between cell proliferation and death. In Brazil, approximately 518,510 new cases of cancer have been estimated from 2012 to 2013, majority being of non melanoma form of skin cancer. Due to so many side effects of the conventional therapies in the treatment of the neoplasias, the photodynamic therapy (PDT) emerges as a safe and highly efficient alternative in the treatment of several types of cancer. This high efficiency results from the straight induction of death of cancer cells , from the destruction of the tumor vasculature and to the reinforcement of the antitumor immunity. PDT is employed with combination molecular oxygen, specific wavelength and photosensitizers. So, the objective of this work was to develop a nanoemulsion (nanoA) with açai oil as a photosensitizer for the application in PDT and investigates the biological effects in vitro and in vivo to evaluate the efficacy in the treatment of non melanoma skin cancer. For This formulation used water, oil and Tween 80 surfactant by the method of phase inversion temperature (PIT). For morphological and colloidal evaluation of nanoA transmission electronic microscopy, scanning electronic microscopy and dynamic dispersal of light Zetasizer were used. The photo-physical properties were evaluated with readings of the spectrum of absorbance and fluorescence in a spectrophotometer. The peak of absorption and emission was in the red region, which is good for application in PDT. The hydrodynamic diameter obtained was 117.5 nm, the middle diameter was 74 nm, the polydispersity index was 0.144 and the zeta potential was -0.536 mV. These features enabled the use of nanoA in biological systems, due to the monodispersity and small diameter favoring the permeation and retention in the tumor (EPR). The capacity of generation of reactive oxygen species was measured through the decline method for benzofuran proving the photochemical activity of the oil, enabling it´s use as a photosensitizer in PDT. The in vitro evaluation consisted of analyses of internalization and distribution of the nanoA in human epidermoid carcinoma cells A431 and in human fibroblast Detroit, as well as of evaluation the cytotoxicity of the cell line subjected to different concentrations of nanoA in the absence and in the presence of light. The normal cell line appeared inert to the incubation with the nanoA whereas the tumoral was more sensitive. The time necessary for nanoemulsion association on cells was fifteen minutes. The in vivo evaluation of the effects of nano A consisted of clinic and histopathological analyses of ortotopic induced tumor by injection of A431 cells in nude mice, treated with three sessions of PDT. As much as drug therapy alone showed antitumor activity. PDT was responsible for 33 % of total regression while the nanoemulsion alone for 16 % of total regression and 33 % of partial regression. These results indicate that this nanoemulsion is good as photosensitizer and a potential new antitumor drug for application in squamous cell carcinoma (SCC), considering the high resistance of this carcinoma and the great efficiency of the treatment