Análise da atividade transcricional dos promotores dos genes p6.9, ie-1, gp64, vp39, p10 e polh do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) e do promotor CMVie1 de um herpesvirus

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013.O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é um dos melhores exemplos do uso de um vírus para controlar a população de um inseto-praga. Este baculovírus infecta larvas da mariposa Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), uma peste do cultivo de soja, e tem sido utilizado como agente de controle biológico no Brasil por mais de duas décadas. Isto depende da habilidade deste vírus gerar dois fenótipos virais, um responsável pela sobrevivência no ambiente fora do hospedeiro, o corpo de oclusão (OB), que é usado como bioinseticida, o outro fenótipo é responsável pela infecção sistêmica, o budded virus (BV), que é uma partícula viral envelopada por membrana da célula hospedeira. Estes dois fenótipos ocorrem em momentos distintos da infecção celular, os BVs na fase tardia e os OBs na fase muito tardia. A regulação temporal e quantitativa da expressão gênica em baculovírus é baseada em transcrição, isto é, a expressão dos genes virais é determinada pela sequência dos promotores que regulam os genes. Neste trabalho, foram isolados os promotores dos genes ie1, gp64, vp39, p6.9, polh, p10 e hel, do baculovírus AgMNPV, e o promotor CMVie1 do Herpesvírus humano CMV, estas sequências reguladoras foram clonadas a montante do gene luciferase de vaga-lume e, a partir disto, baculovírus AgMNPV recombinantes foram construídos por recombinação homóloga. Isto permitiu avaliar a atividade de cada promotor durante a infecção de células de inseto permissivas e não-permissivas, além de quantificar a atividade dos promotores durante a infecção de larvas Anticarsia gemmatalis e Spodoptera frugiperda. Os promotores vp39, p6.9 e polh foram os mais produtivos nos ensaios de expressão em células de inseto e lagartas. Também foi possível confirmar que o AgMNPV é capaz de transduzir células de mamíferos cultivadas in vitro. Este trabalho serve como uma demonstração do uso do baculovírus AgMNPV como vetor de expressão de proteínas heterólogas. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is one of the best examples of the use of a virus to control an insect pest in agriculture worldwide. This baculovirus infects larvae of Anticarsia gemmatalis moth (Lepidoptera), a soy bean pest, and has been used as a successful biocontrol agent in Brazil for over two decades. This depends on the unique ability to generate two viral phenotypes, one responsible for the viral survival in the environment outside the host and the agent of primary infection, which consists of viral particles encapsulated into a polyhedral shaped protein crystal, the occlusion body (OB), which is used as a bioinsecticide, and a second phenotype, the budded virus (BV), which is a single membrane-containing viral particle. The temporal and quantitative regulation of gene expression in baculoviruses is transcription based, that is, the expression is determined by the sequence of the gene regulating promoters. In this work, the promoters of the AgMNPV ie1, gp64, vp39, p6.9, polh, p10 and hel genes and the Herpesvirus CMVie1 promoter, have been isolated and cloned upstream of the firefly luciferase gene, and recombinant AgMNPV baculoviruses were constructed by homologous recombination. The activity of each promoter was analysed during permissible and non-permissible insect cell infections, and during the infection of the Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda larvae. The vp39, p6.9 and polh promoters were the most efficient in the protein expression assays conducted in insect cells and larvae. It was also possible to confirm that the AgMNPV baculovirus is capable of transducing mammalian cells grown in vitro. This work is a demonstration of the biotecnological potential of the AgMNPV baculovirus as a vector for the expression of heterologous proteins