Identificação e avaliação do efeito antinociceptivo da protonectina natural e modificada da peçonha da vespa social Parachartergus fraternus

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2013.Peçonhas de vespas são formadas por um conjunto de moléculas com diversas ações farmacológicas, como as aminas biogênicas, as acilpoliaminas e os peptídeos, sendo estes últimos os mais abundantes. Atualmente, compostos neuroativos isolados de peçonhas de animais tem despertado grande interesse devido a seu potencial no desenho de novas drogas para prevenir ou tratar doenças como dor crônica, epilepsia e Parkinson, assim como novas ferramentas farmacológicas. Neste contexto, o estudo da peçonha de vespas tem proporcionado à descoberta de novos compostos neuroativos, mas, ainda, até o momento, a grande maioria dos peptídeos não foi identificada e avaliada. A vespa social Parachartergus fraternus tem uma marcante peculiaridade: embora estas vespas vivam em comunidade, a ação da sua peçonha é capaz de paralisar a presa de modo irreversível e não letal o que difere de outras vespas sociais que a utiliza apenas para proteção contra predadores. Esta diferença indica a presença de compostos com ação em estruturas do sistema nervoso. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi a identificação e o isolamento de peptídeos antinociceptivos da peçonha de P. fraternus. A peçonha de P. fraternus foi analisada por duas estratégias: fracionamento por CLAE seguido de MALDI/TOF e a construção da biblioteca de cDNA e sequenciamento. Uma fração específica foi separada por CLAE e após ser sequenciada de novo, teve sua sequência parcialmente determinada, com diversas ambiguidades e especialmente, entre Leucina e Isoleucina. Em relação ao transcritoma, um clone da biblioteca de cDNA foi identificado que codifica o peptídeo, o que possibilitou a completa determinação da sequência peptídica. A análise do sequenciamento revelou a presença de um precursor do peptídeo maduro, composto por um propeptídeo de 61 aminoácidos e com um possível sinal de clivagem. A sequência do peptídeo maduro foi determinada como ILGTILGLLKGL-NH2. Após busca nos bancos de dados, este peptídeo mostrou homologia com a Protonectina, identificada anteriormente na vespa Protonectarina sylveirae. Para o peptídeo sintético, duas modificações foram desenhadas e o peptídeo IFGTILGFLKGL-NH2 foi produzido ®por síntese em fase sólida (Aminotech ). A atividade antinociceptiva dos dois peptídeos foi avaliada utilizando o modelo de placa quente em camundongos Swiss (n=4-6/grupo). Os peptídeos foram injetados por via i.c.v. nas concentrações de 16 e 8 nmol/animal diluídas em solução veículo quatro dias após a implantação da cânula guia. Como controle positivo foi utilizado morfina (16nmol/animal) e como controle negativo foi utilizado água deionizada como veículo. A atividade antinociceptiva do peptídeo natural foi efetiva na concentração de 8 nmol/animal em 90, 120 e 240 min (p0,05) da morfina em todos os tempos testados (240min). O peptídeo sintético não mostrou atividade hemolítica, assim como o descrito na literatura para o peptídeo natural. Ao contrário do peptídeo natural, animais injetados com o peptídeo sintético não apresentaram déficit motor, na maior dose testada no teste de antinocicepção. Esses resultados corroboram a hipótese de que a peçonha de vespas possui um grupo de moléculas que atuam no SNC de mamíferos. O peptídeo sintético mostrou potencial de contribuir com o desenvolvimento da neurociência na elucidação da transmissão sináptica e no desenho de novas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTWasp venoms are formed by several molecules, such as biogenic amines, acylpoliamines and peptides which are the most abundant component. Neuroactive compounds are of great interest for their relevant potential to design new drugs, important to prevent and/or treat diseases such as chronic pain, epilepsy and Parkinson, as well as to develop other pharmacological tools. In this context, the study of wasp venoms has lead to the discovery of neuroactive molecules, however most peptides have yet to be identified or characterized. The social wasp Parachartergus fraternus has a remarkable peculiarity: although these wasps live in community, their venom act by irreversibly and non-lethally paralyzing their prey, which differs from other social wasps, which typically uses the venom only for protection against prey. This difference in the mode of action suggests the presence of compounds with activity in the nervous system. For this reason, the aim of this study was the identification and isolation of antinociceptive peptides in the venom of P. fraternus. The venom of P. fraternus was analyzed by two complementary strategies: HPLC fractionation followed by MALDI-TOF analysis and cDNA library construction and sequencing. A specific fraction was identified by mass spectrometry (MALDI-TOF), however sequencing of this fraction was unable to unambiguously determine between Leucine and Isoleucine. Using the transcriptomic approach, the sequence of the precursor encoding this peptide was identified. The precursor encodes a propeptide of 61 amino acids with a putative signal peptide. The sequence of the mature peptide was determined as ILGTILGLLKGL-NH2. Similarity search in public databases showed that this peptide is identical to Protonectin isolated from Protonectarina sylveirae. A synthetic peptide with two amino acid substitutions, IFGTILGFLKGL-NH2, was produced by solid phase synthesis (Aminotech). Antinociceptive activity of both peptides was evaluated by the hot plate model in Swiss mice (n=4-6/group). The peptides were infused via i.c.v. at doses of 16 and 8 nmol/animal (in vehicle solution) four days after the implantation of the guide cannula. Morphine (16nmol/animal) was used as positive control and vehicle solution was used as negative control (2µL/animal). The analgesic activity of the natural isolated peptide was shown to be effective at 8 nmol/animal (p<0.05) in the time points of 90, 120 and 240 min whereas the higher dose of 16 nmol/animal showed a decreased effect, probably due to neurotoxicity. The synthetic peptide had a dose- dependent response, where the highest dose (16 nmol/animal) showed antinociceptive activity that did not differ (p