Frequências dos polimorfismos nos genes da haptoglobina e mieloperoxidase (-G463A) em pacientes com doença falciforme (SS) e correlação com a gravidade clínica da sobrecarga de ferro

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2013.O íon ferro é fundamental para a homeostase celular; porém, pode ser altamente danoso ao organismo quando se encontra livre, pois sua capacidade de aceitar ou doar elétrons permite catalisar a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). Em circunstâncias normais, essa reação é minimizada pelo sequestro de ferro dentro de complexos com proteínas; na sobrecarga de ferro, os depósitos de ferro estão livres para promover a produção de ERO, sendo esta inevitável em pacientes que recebem transfusões frequentes, como na doença falciforme. A haptoglobina (Hp) é uma glicoproteína que se liga à hemoglobina (Hb) livre formando o complexo Hp-Hb que é essencial para a remoção de Hb do plasma, tendo um papel crucial contra o estresse oxidativo induzido por Hb. Outra proteína relacionada ao estresse oxidativo é a mieloperoxidase (MPO), uma enzima lisossômica com atividade microbicida oxigênio-dependente presente em monócitos e neutrófilos. Visto que ambas as proteínas apresentam polimorfismo genético que pode influenciar na proteção contra o estresse oxidativo, o objetivo do presente trabalho foi investigar a frequência dos polimorfismos nos genes da Hp e da MPO (G463A) em pacientes com doença falciforme (SS) e sua correlação com a gravidade clínica da sobrecarga de ferro, visando avaliar uma possível associação entre esses polimorfismos com a variabilidade clínica, a resposta aos tratamentos e o prognóstico, especialmente aqueles relacionados ao estresse oxidativo. Para tal, foi realizado um estudo transversal com amostra de conveniência composta por 78 pacientes com diagnóstico de doença falciforme atendidos no Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF), sem e com sobrecarga de ferro. Os dados foram obtidos através de exames laboratoriais, questionário, pesquisa em prontuários e análises dos polimorfismos por métodos baseados na reação em cadeia da polimerase. Correlação positiva foi encontrada entre os genótipos de Hp e valores de ferritina (p=0,035; coeficiente de correlação de Spearman=0,239), tratamento com hidroxiureia (p=0,031; coeficiente de contingência= 0,369), internação por acidente vascular-cerebral (AVC) (p=0,023; coeficiente de contingência=0,379) e sequelas por AVC (p=0,031; coeficiente de contingência= 0,368), e entre os genótipos de MPO e número de internações no último ano (p=0,049; coeficiente de contingência= 0,332) e esplenectomia (p=0,024; coeficiente de contingência= 0,297). Associação significativa entre genótipos específicos da Hp e comorbidades também foram encontradas, enquanto para MPO os resultados sugeriram que a homozigose AA poderia potencializar os efeitos da asplenia. Desvio significativo no equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado apenas para o polimorfismo da Hp, sendo este compatível com deficiência de heterozigotos, sugerindo uma possível existência de seleção natural desfavorecendo o genótipo 1S-2 entre os pacientes com doença falciforme. Os resultados do Odds Ratio sugeriram a possibilidade de que principalmente o aumento de chances de hospitalização por AVC (OR= 6,346; IC 95%= 1,56–25,79; p=0,005) e de sequelas por AVC (OR= 6,556; IC 95%= 1,578–27,237; p=0,005) poderiam estar associados à menor frequência observada de 1S-2 em relação ao esperado. Apesar de não haver diferenças nas frequências genotípicas entre os grupos sem e com sobrecarga de ferro para nenhum dos polimorfismos analisados, quando analisadas as interações entre os polimorfismos, efeitos significativos foram mostrados apenas no grupo sem sobrecarga para o polimorfismo de Hp nos valores de proteína C-reativa ultra-sensível (PCR-us) (p=0,000) e número de transfusões (p=0,018), o mesmo ocorrendo em relação ao polimorfismo de MPO nos valores de PCR-us (p=0,000), e para a interação entre Hp/MPO também nos valores de PCR-us (p=0,000). Diferenças significativas nas comparações 2-a-2 foram observadas para MPO entre os genótipos GG e AA e entre GA e AA (p=0,000 para ambos). Apesar da associação reportada entre o fenótipo Hp1-1 e doença falciforme, nossos resultados corroboram outros indicando que existem *1diferenças entre os subtipos do alelo Hp . Esses resultados ressaltam a importância do presente estudo para um melhor entendimento do significado biológico do polimorfismo de Hp na variabilidade clínica e resposta aos tratamentos de indivíduos falcêmicos na nossa população, e também sugerem que a homozigose AA da MPO pode potencializar os efeitos da asplenia nesses indivíduos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe iron ion is essential for cellular homeostasis; however, it can be highly damaging to the body when it is free, because its ability to accept or donate electrons allows the formation of reactive oxygen species (ROS) to be catalyzed. Under normal circumstances, this reaction is minimized by sequestering iron in complexes with proteins. However, in iron overload, iron deposits are free to promote the production of ROS, which is inevitable in patients who receive frequent transfusions, as occurs in sickle cell anemia. Haptoglobin (Hp) is a glycoprotein which binds free hemoglobin (Hb), forming the Hp-Hb complex that is essential for removal of plasma Hb, having a crucial role against oxidative stress induced by Hb. Another protein related to oxidative stress is myeloperoxidase (MPO), a lysosomal enzyme with oxygen-dependent microbicidal activity present in monocytes and neutrophils. Since both proteins show genetic polymorphisms that may influence the protection against oxidative stress, the objective of this study was to investigate the frequency of polymorphisms in the Hp and MPO ( G463A) genes of patients with sickle cell disease (SS) and its correlation with the clinical severity of iron overload, aiming to evaluate a possible association between these polymorphisms and clinical variability, response to treatment and prognosis, especially those related to oxidative stress. To this end, we conducted a cross-sectional study with a convenience sample comprising 78 patients with sickle cell disease treated at Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF), with and without iron overload. Data were obtained from laboratory tests, questionnaires, the medical records and analysis of the polymorphisms by methods based on polymerase chain reaction. Positive correlations was found between Hp genotypes and values of ferritin levels (p=0.035, Spearman's correlation coefficient= 0.239), treatment with hydroxyurea (p=0.031, contingency coefficient= 0.369), hospitalization for stroke (p=0.023, contingency coefficient= 0.379) and sequelae of stroke (p=0.031, contingency coefficient= 0.368); and between MPO genotypes and number of hospitalizations in the past 12 months (p=0.049; contingency coefficient= 0.332) and splenectomy (p=0.024, contingency coefficient= 0.297). Significant associations between specific Hp genotypes and comorbidities were also found, while for MPO, results suggested that AA homozygosis could increase the effects of asplenia. Significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium was observed only for the Hp polymorphism, which was compatible with heterozygous deficit, suggesting a possible existence of natural selection disfavoring the 1S-2 genotype among patients with sickle cell anemia. Results of the Odds Ratio suggested the possibility that mainly increased chances of hospitalization for stroke (OR= 6.346; IC 95%= 1.56–25.79; p=0.005) and of sequelae from stroke (OR= 6.556; IC 95%= 1.578–27.237; p=0.005) could be associated with less frequently observed 1S-2 than was expected. Although no differences were observed in genotype frequencies between the groups with and without iron overload for any of the polymorphisms analyzed, when the interactions between the polymorphisms were analyzed, significant effects between subjects were shown only in the group without overload for Hp polymorphism in the values of high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP; p=0.000) and number of transfusions (p=0.018), with the same occurring for MPO polymorphism (p=0.000) and the interaction between Hp/MPO (p=0.000) with hs-CRP values. Significant differences in 2-to-2 comparisons were observed for MPO between the genotypes GG and AA (p=0.000), and GA and AA (p=0.000) in the hs-CRP levels. Despite the reported association between Hp1-1 phenotype and sickle cell disease, our results corroborate others *1indicating that there are biological differences between the Hp allele subtypes. These results highlight the importance of this study to better understand the biological significance of Hp polymorphism in the clinical variability and response to treatment of individuals with sickle cell disease in our population, and also suggest that MPO AA homozygosis may increase the effects of asplenia in these individuals