Avaliação da atividade antifúngica da anfotericina b conjugada com nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido laurico no tratamento da paracoccidioidomicose

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012.A paracoccidioidomicose, Pbmicose, é uma micose sistêmica autóctone da América central e do sul, de caráter endêmico entre as populações de zona rural. Dentre os fármacos mais utilizados no tratamento da Pbmicose destacam-se o Itraconazol e a Anfotericina B. Este último possui amplo espectro antifúngico e potente atividade fungicida. Apesar disso, induz em humanos diversos efeitos adversos, principalmente a nefrotoxicidade. Nesse contexto, novas estratégias tais como a ligação da Anfotericina B a estruturas biocompatíveis têm sido desenvolvidas para diminuir a sua concentração no plasma sanguíneo e aumentar nos órgãos alvos da terapia e, assim, reduzir os efeitos colaterais induzidos por esse fármaco. Dentre essas estruturas destacam-se os materiais nanoestruturados como as nanopartículas magnéticas. Entretanto, para serem utilizadas na biomedicina essas nanopartículas devem ser biodegradáveis, hemocompatíveis e não tóxicas ao organismo. Para tal, é importante que elas sejam recobertas por substâncias estabilizantes. Nesse sentido, a fim de desenvolver um sistema controlado de entrega de drogas e de reduzir os efeitos colaterais da Anfotericina B, conjugou-se esse fármaco a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia da Anfotericina B quando conjugada a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico, FM-BlaAmB, no tratamento da Pbmicose experimental. Inicialmente, fez-se necessário avaliar se a Anfotericina B nesse complexo mantinha atividade antifúngica e se era tóxica para células de mamíferos. Assim, o fungo Paracoccidioides brasiliensis, isolado virulento 18 (Pb18) e células mesangiais humanas e macrófagos peritoneais murinos foram tratadas, in vitro, com FM-BlaAmB. Os resultados demonstram que a Anfotericina B no complexo FM-BlaAmB mantém a atividade antifúngica similar a Ambisome® e não é tóxica para células de mamíferos. Diante desses dados promissores decidiu-se realizar ensaios in vivo de modo a verificar se a Anfotericina B no complexo FM-BlaAmB era eficaz na Pbmicose experimental, sem, entretanto, ser tóxica para o hospedeiro. Para tal, camundongos BALB/c foram infectados com o fungo III Pb18 e tratados com o complexo durante as formas aguda e crônica da doença, por 30 e 60 dias. A determinação da carga fúngica no pulmão, a histopatologia dos órgãos pulmão, baço, fígado e rim, além da quantificação de citocinas e do DNA fragmentado em células de medula óssea foram realizadas 24 horas após o último tratamento. Os resultados mostram que a Anfotericina B no complexo é eficaz contra a paracoccidioidomicose experimental na infecção aguda, mas não na infecção crônica e não induz alterações bioquímicas e clínicas nem histopatológicas no fígado, nos rins nem no baço de camundongos BALB/c. Ela também não induz efeitos genotóxicos em células da medula óssea desses animais. Assim sendo, é plausível acreditar que a Anfotericina B quando conjugada a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico, por apresentar similar capacidade antifúngica e não induzir efeitos adversos em doses terapêuticas na infecção aguda, além de permitir a diminuição do número de aplicações no tratamento da Pbmicose murina, possa ser uma alternativa ao uso das formulações de Anfotericina B deoxicolato e Ambisome®. Porém estudos posteriores são necessários para melhorar a eficácia no tratamento da infecção crônica. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTParacoccidioidomycosis, PCM, systemic mycosis is a native of Central and South America, the endemic among rural populations. Among the most commonly used drugs in the treatment of PCM stand out Itraconazole and Amphotericin B. The latter has broad spectrum antifungal and potent fungicidal activity. Nevertheless, induces several side effects in humans, particularly nephrotoxicity. In this context, new strategies such as the binding of amphotericin B to biocompatible structures have been developed to reduce its concentration in blood plasma and increase in target organs of therapy and thereby reduce the side effects induced by this drug. Among these structures stand out nanostructured materials as magnetic nanoparticles. However, for use in biomedicine these nanoparticles should be biodegradable and non-toxic hemocompatíveis the body. For this it is important that they are coated by stabilizing substances. Accordingly, in order to develop a system controlled delivery of drugs and reduce side effects of Amphotericin B, this drug is conjugated to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid. This study aimed to evaluate the efficacy of amphotericin B when coupled to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid, FM-BlaAmB in experimental treatment of PCM. Initially, it was necessary to assess whether this Complex Amphotericin B had antifungal activity and was toxic to mammalian cells. Thus, Paracoccidioides brasiliensis, virulent isolate 18 (Pb18), and human mesangial cells and murine peritoneal macrophages were treated in vitro with FM-BlaAmB. The results show that the amphotericin B in the complex FM-BlaAmB mantéma antifungal activity similar to Ambisome ® and is not toxic to mammalian cells. Given these encouraging data was decided to conduct in vivo tests to verify that the Amphotericin B in the complex FM-BlaAmB was effective in experimental Pbmicose, without, however, be toxic to the host fungus. To this end, BALB / c mice were infected with the fungus Pb18 and treated with the compound during the acute and chronic forms of the disease for 30 and 60 days. The determination of the fungal load in the lung histopathology of organs such as lung, spleen, liver and kidney in addition to the quantification of cytokines and the fragmented DNA into bone marrow cells were performed 24 hours after the last treatment. The results show that the amphotericin B in the complex is effective against paracoccidioidomycosis infection in experimental acute, but not chronic infection and does not induce clinical or biochemical and histopathological liver, kidney or spleen of BALB / c mice. It also does not induce genotoxic effects in bone marrow cells of these animals. Therefore, it is reasonable to believe that the Amphotericin B when coupled to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid, by having similar antifungal capacity and do not induce adverse effects at therapeutic doses in acute infection and also allows reducing the number of applications in the treatment of PCM murine, can be an alternative to the use of the formulations of amphotericin B deoxycholate and Ambisome ®. But further studies are needed to improve effectiveness in the treatment of chronic infection