Modificações genéticas em linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae para a fermentação de xilose

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012.Para a produção economicamente viável de etanol de segunda geração a partir de bagaço de cana são necessários vários avanços tecnológicos em diferentes etapas deste bioprocesso incluindo o melhoramento genético de microrganismos fermentadores. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais usado para tal por ser uma excelente fermentadora e tolerante aos estresses dos grandes processos fermentativos industriais. Dentre os principais açúcares que compõem o bagaço de cana, destaca-se a xilose, uma pentose que pertence à fração hemicelulósica. Todavia, S. cerevisiae só utiliza hexoses na fermentação, não sendo capaz de metabolizar pentoses. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma levedura capaz de fermentar xilose. Inicialmente, foi feito um estudo das características genéticas da linhagem industrial de S. cerevisiae JP1 – microrganismo hospedeiro selecionado como alvo das modificações desejadas (Capítulo 1). Pode-se verificar que a linhagem JP1 é diploide e heterotálica. Mostrou-se também sensível às principais drogas usadas em processo de seleção de recombinantes assim com uma boa eficiência de transformação. Além disso, foi construída uma linhagem auxotrófica para uracila com a dupla deleção do gene URA3. Posteriormente, a linhagem JP1 foi modificada geneticamente para se tornar capaz de fermentar xilose a etanol (Capítulo 2). Foram construídos cassetes de expressão para duas enzimas da via metabólica de xilose - xilose isomerase e xiluloquinase – clonados em vetor epissomal. A linhagem recombinante obtida foi submetida à adaptação metabólica por 48 dias em meio contendo apenas xilose como fonte de carbono, levando a um aumento na taxa de crescimento de 0,008 h-1para 0,13 h-1. Estudos preliminares de fermentação em meio sintético mostrou um acúmulo de xilitol (YX/S = 0,29 g g-1) e baixa produção de etanol (YE/S = 0,27 g g-1). Para incrementar a produção de etanol, um cassete de deleção para o gene GRE3 (aldose redutase) foi desenvolvido. Além disso, consideramos a introdução de um gene codificador para um transportador com afinidade por xilose, visando aumentar o influxo de xilose para a célula. Para tanto, foi iniciada uma análise transcricional da levedura Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 adaptada ao hidrolisado de bagaço de cana a fim de compreender a regulação em diferentes concentraçõesde xilose e glicose, além de selecionar um possível transportador de xilose para ser expresso em S. cerevisiae (Capítulo 3). Dados preliminares indicam que o gene com maior expressão em xilose foi XYL3 e, dentre os transportadores putativos de xilose, XUT1. Esse trabalho representou uma das primeiras iniciativas no País no emprego de abordagens de engenharia metabólica para o desenvolvimento de um bioprocesso em linhagem industrial de S. cerevisiae. No seu conjunto, nossos resultados preliminares mostram que o desenvolvimento da tecnologia nacional para a produção de álcool lignocelulósico utilizando microrganismos modificados geneticamente é plenamente viável. Embora a linhagem obtida nesse estudo não tenha apresentado rendimentos de etanol desejáveis a partir de xilose, foi demonstrada a eficácia das ferramentas moleculares desenvolvidas que poderão ser empregada em futuros estudos. Além disso, comprovamos que as características genéticas da linhagem industrial JP1 a tornam uma interessante plataforma para futuras modificações relacionadas a outros bioprocessos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTIn order to achieve cost-effective, second-generation ethanol production from sugarcane bagasse, several stages of this bioprocess need to be technologically upgraded, which includes the genetic improvement of fermenting microorganisms. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most employed microbe to this purpose due to its excellent fermentative properties and high tolerance to the stressing conditions of large-scale industrial fermentation. Among the sugars that constitute sugarcane bagasse, xylose, a pentose abundant in the hemicellulosic fraction, is one of the most important. However, S. cerevisiae only uses hexoses in fermentation and is incapable of catabolising pentoses. The main goal of this project was to develop a xylose-fermenting yeast strain. Initially, we made genetic profiled the industrial S. cerevisiae strain JP1, which was to be subjected to the genetic manipulations in the pursuit of our goal (Chapter 1). We assessed that JP1 is diploid and heterothallic. It was also shown to be susceptible to the main drugs used in recombinant derivative selection and to be transformable with good efficiency. Next, we created an uracyl-auxotroph derivative by double-deleting the URA3 gene. Later, the JP1 strain was genetically modified to become able to ferment xylose to ethanol (Chapter 2). We created expression cassettes for two enzymes of the xylose catabolic pathway – xylose isomerase and xylulokinase – cloned into an episomal vector. The recombinant strain was submitted to metabolic adaptation for 48 days in medium with xylose as the sole carbon source, which led to an increase in the growth rate from 0.008 h-1 to 0.13 h-1. Preliminary studies of fermentation in synthetic medium revealed a buildup of xylitol (YX/S= 0,29 g g-1) and low ethanol production (YE/S= 0,27 g g-1) by this strain. In order to increase ethanol production, a deletion cassette for the GRE3 gene (aldose reductase) was developed. In addition, we considered introducing a gene coding for a membrane transporter with affinity for xylose to increase the influx of xylose to cell. To this end, we carried out a transcriptional analysis of the yeast Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 that had been adapted to sugarcane bagasse hydrolysate in order to understand gene regulation under different xylose and glucose concentrations and thus select a putative xylose transporter that could be expressed in S. cerevisiae (Chapter 3). Preliminary data indicate that the most upregulated gene with xylose as carbon source was XYL3 and, among putative xylose transporters, XUT1. The present work was one of the first attempts in the country to use metabolic engineering to develop a bioprocess in an industrial strain of S. cerevisiae. Overall, our preliminary results show that it is fully possible to develop national technology for production of ethanol from lignocellulosic residues using genetically modified microorganisms. Although the strain obtained in the present study did not show the desired ethanol yield from xylose, the molecular tools developed in this work were shown to be effective and validated to be used in future studies. Besides, we showed that the genetic features of the industrial strain JP1 make it interesting for future modifications related to other bioprocesses