Desenvolvimento de um método molecular para detecção e identificação de Xanthomonas campestris pv. viticola

ABSTRACTCom o objetivo de desenvolver um método molecular para detecção e identificação de Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), agente causal do cancro bacteriano da videira, oligonucleotídeos (primers) foram desenhados com base na seqüência parcial do gene hrpB. As combinações de primers Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R que amplificaram fragmentos de 243 e 340 pb, respectivamente, foram testadas quanto à especificidade e sensibilidade para detecção do DNA de Xcv. Com os dois pares de primers, amplificação foi positiva com o DNA de 44 isolados de Xcv, mas também com quatro isolados de X.c. pv. mangiferaeindicae e cinco de X. axonopodis pv. passiflorae. Contudo, a digestão dos produtos de PCR permitiu diferenciar Xcv dos isolados desses patovares. Nenhum dos dois pares de primers amplificou o DNA de videira, nem de 20 bactérias não patogênicas isoladas da flora da videira, ou de 10 isolados de outros seis gêneros de bactérias fitopatogênicas. A sensibilidade dos primers Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foi de 10 pg e 1 pg de DNA purificado de Xcv, respectivamente. O limite de detecção de RST2/Xcv3R foi de 104 UFC/ml, mas empregando-se uma segunda rodada de amplificação com o primer interno Xcv1F, esse limite foi de 102 UFC/ml. Não foi possível detectar por PCR a presença de Xcv usando-se, diretamente na reação, o extrato do macerado de pecíolos de videira previamente inoculados. Entretanto, amplificações foram positivas quando se utilizou uma etapa de enriquecimento em meio de cultura antes da PCR. Detectou-se Xcv em 1 µl da suspensão obtida do lavado das placas e em uma suspensão obtida a partir de uma única colônia. A identidade da bactéria foi confirmada pela análise de RFLP dos produtos de amplificação dos primers RST2/Xcv3R com HaeIII.In order to develop a molecular method for detection and identification of Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) the causal agent of grapevine bacterial canker, primers were designed based on the partial sequence of the hrpB gene. Primer pairs Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R, which amplified 243- and 340-bp fragments, respectively, were tested for specificity and sensitivity in detecting DNA from Xcv. Amplification was positive with DNA from 44 Xcv strains and with DNA from four strains of X. campestris pv. mangiferaeindicae and five strains of X. axonopodis pv. passiflorae, with both primer pairs. However, the enzymatic digestion of PCR products could differentiate Xcv strains from the others. None of the primer pairs amplified DNA from grapevine, from 20 strains of nonpathogenic bacteria from grape leaves and 10 strains from six representative genera of plant pathogenic bacteria. Sensitivity of primers Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R was 10 pg and 1 pg of purified Xcv DNA, respectively. Detection limit of primers RST2/Xcv3R was 104 CFU/ml, but this limit could be lowered to 102 CFU/ml with a second round of amplification using the internal primer Xcv1F. Presence of Xcv in tissues of grapevine petioles previously inoculated with Xcv could not be detected by PCR using macerated extract added directly in the reaction. However, amplification was positive with the introduction of an agar plating step prior to PCR. Xcv could be detected in 1 µl of the plate wash and from a cell suspension obtained from a single colony. Bacterium identity was confirmed by RFLP analysis of the RST2/Xcv3R amplification products digested with Hae III