Análise morfológica e proteômica da captação de nanopartículas de dióxido de titânio por neutrófilos humanos in vitro

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012.O crescente uso de nanomateriais como dióxido de titânio (TiO 2) em seres humanos na área biomédica, cosmética, alimentícia entre outras, tem estimulado pesquisas sobre toxicidade pelo potencial risco à saúde humana. Alguns aspectos da resposta inflamatória ao titânio no organismo ainda não foram completamente elucidados. Sabe-se que a exposição celular a nanopartículas (NPs) de TiO 2 pode induzir estresse oxidativo que desencadeia uma cascata de eventos com sinalização celular, respostas inflamatórias, proliferativas e genotóxicas. Os neutrófilos (PMNs) representam a primeira linha de defesa celular imunológica do organismo, sendo ativados e rapidamente recrutados para as regiões onde as NPs de TiO 2 foram implantadas. Este estudo teve como objetivo analisar as interações de neutrófilos humanos com NPs de TiO 2 in vitro, em diferentes tempos de exposição (1, 5, 30 e 60 minutos). A análise morfológica da interação foi obtida por microscopias de luz, eletrônica de varredura e de transmissão enquanto a espectroscopia de força atômica permitiu a análise das modificações mecânicas dos PMNs. A expressão de moléculas de adesão, CD-11b e CD-62L foi analisada por Citometria de Fluxo e o teste do Nitroblue tetrazolium (NBT) possibilitou a avaliação da produção de ânion superóxido pelos PMNs após incubação com NPs de TiO 2 . A eletroforese bidimensional de extratos protéicos de neutrófilos quiescentes e ativados por TiO 2 no tempo 30 minutos permitiu a comparação de mapas proteômicos e a identificação de proteínas por PMF (Peptide Mass Fingerprinting). As análises por microscopia de luz, de varredura e transmissão demonstraram que o fator tempo teve um efeito significativo sobre a capacidade de fagocitose e as alterações da morfologia dos PMNs. As análises de citometria de fluxo não demonstraram correlação entre as alterações morfológicas e do citoesqueleto e a expressão de moléculas de adesão (CD-11b e CD-62L). Ativação celular e produção de ânion superóxido foram demonstrados pelo teste do NBT ao longo do tempo. A espectroscopia de força atômica demonstrou aumento das forças de atração, de adesão bem como da rigidez, elasticidade e energia dissipada nos PMNs. A análise comparativa dos géis bidimensionais resultou em 7 spots com diferença significativa de abundância (p≤0,05), dos quais 3 proteínas foram identificadas por PMF. Tais proteínas têm funções relacionadas à regulação da organização do citoesqueleto, fagocitose e ao ciclo celular. O presente estudo representa uma contribuição para o esclarecimento dos mecanismos fisiológicos celulares envolvidos na interação de nanomateriais com o organismo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe increasing use of nanomaterials such as titanium dioxide (TiO 2) in humans in the biomedical, cosmetics, food and other fields, has stimulated the research on toxicity, due to the potential risk to human health. Some molecular aspects of the inflammatory response after implantation of titanium in the body has not yet been fully elucidated. It is known that the exposure of cells to nanoparticles (NPs) can induce oxidative stress that triggers a cascade of events resulting in cell signaling, inflammatory, proliferative and genotoxic responses. Neutrophils are the first line of cellular immunological defense and are quickly recruited to the titanium implantation areas. The present study aimed to analyze the interactions of human neutrophils with TiO 2 NPs in vitro at different incubation times (1, 5, 30 and 60 minutes). The morphological characteristics of this interaction were analyzed by light, electron scanning and transmission microscopy, whilst atomic force spectroscopy allowed PMNs mechanical forces analysis. The expression of adhesion molecules, CD-11b and CD-62L, was analyzed by Flow Cytometry and the Nitroblue tetrazolium (NBT) test enabled the evaluation of superoxide anion production by PMN after incubation with TiO 2 NPs. The two-dimensional electrophoresis of protein extracts from quiescent and TiO 2 activated neutrophils after 30 minutes of incubation allowed the comparison of proteomic maps and protein identification by PMF (Peptide Mass Fingerprint). Light, scanning and transmission microscopies results showed that the time factor had a significant effect on PMNs phagocytosis and morphology changes. Flow cytometry analysis showed no correlation between adhesion molecules expression (CD-11b and CD-62L) and morphological alterations. The NBT test demonstrated PMNs activation and superoxide anion production after exposure to TiO 2 NPs. Moreover, atomic force spectroscopy demonstrated increased parameters for attractive and adhesion forces, stiffness, elasticity and dissipated energy in PMNs along the time course. The comparative analysis of two-dimensional gels resulted in 7 spots with statistically significant abundance (p ≤ 0.05), among which 3 proteins were identified by PMF. The identified proteins are related to the regulation of cytoskeleton organization, phagocytosis and cell cycle. This study represents a contribution to the elucidation of the physiological mechanisms involved in cellular interactions of nanomaterials with the body