Desenvolvimento e validação de métodos voltamétricos de análise para a determinação de metabólitos secundários em amostras de soja

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Química, 2012.A voltametria cíclica (CV) foi utilizada para estudar o processo de oxidação/redução de metabólitos secundários da soja, na forma livre ou complexada com o Cu(II), nos eletrodos de carbono vítreo (GC) e de mercúrio de gota pendente (HMDE). Três eletrodos (HMDE, eletrodos sólidos de GC e grafite) e três diferentes técnicas voltamétricas (voltametria adsortiva de redissolução catódica (CAdSV), voltametria adsortiva de redissolução (AdSV) e voltametria de pulso diferencial (DPV)) foram utilizados no desenvolvimento de dez métodos de análise de metabólitos secundários de soja. Dois destes métodos desenvolvidos foram selecionados para a análise de comprimidos à base de extrato de soja, quatro amostras preparadas de isoflavonas e folhas e grãos de soja de cinco cultivares. No estudo do processo de oxidação/redução das isoflavonas no eletrodo de GC foram observados picos irreversíveis, correspondentes a oxidação do 4’-hidróxi do anel B. Para a rutina no eletrodo de GC, observou-se um pico reversível, correspondente à oxidação do 3’,4’- dihidróxi do anel B e um pico irreversível correspondente à oxidação do 5,7-dihidróxi do anel A. No estudo do processo de oxidação/redução do complexo Cu(II)-rutina no HMDE foi observado um pico de redução quasi-reversível. O primeiro método voltamétrico desenvolvido e selecionado para as análises, baseado na acumulação do complexo Cu(II)-rutina no HMDE, utilizando-se a CAdSV, apresentou limite de detecção da ordem de 10-9 mol L-1 e foi aplicado na determinação de rutina em grãos e folhas de soja. Nos grãos das cultivares P98R62, BRQ 96-3065 e Dowling e nas folhas da cultivar Dowling não foi detectada rutina. No entanto, para as folhas da cultivar IAC 100, este flavonóide foi detectado com concentração média de 0,197 mg g-1. A recuperação de rutina adicionada variou de 94 a 105%, indicando ausência de efeito de matriz. O segundo método voltamétrico desenvolvido e selecionado para as análises, baseado na oxidação das isoflavonas no eletrodo de GC, utilizando-se a DPV, apresentou limite de detecção da ordem de 10-7 mol L-1 e foi aplicado na determinação de isoflavonas totais em: quatro amostras preparadas de isoflavonas, comprimidos a base de extrato soja e grãos da cultivar Flora. Nas análises das amostras preparadas, observou-se que os menores valores de erros relativos foram obtidos na amostra de composição semelhante aos produtos à base de soja fermentados. Estes resultados indicam a necessidade do processo de hidrólise ácida na preparação das amostras de grãos de soja, com o objetivo de minimizar a interferência das formas glicosiladas na quantificação de isoflavonas totais. A concentração média de isoflavonas totais no comprimido à base de extrato de soja foi 31,44 mg comprimido-1, com erro relativo menor que 10% em relação ao indicado no rótulo. Na determinação de isoflavonas totais em grãos de soja da cultivar Flora, foi realizada uma extração em fase sólida para a remoção dos interferentes, e foi obtida uma concentração média de isoflavonas totais de 0,184 mg g-1. Este valor é próximo ao encontrado em grãos de soja de três genótipos cultivados em Londrina (PR). A recuperação de daidzeína ou genisteína adicionada indica ausência de efeito de matriz. Os estudos realizados com o primeiro método, quanto à concentração de rutina, e com o segundo método, quanto à identificação e quantificação de isoflavonas totais, em cultivares de soja, poderão ser aplicados no manejo integrado de pragas e em programas de melhoramento genético; contribuindo para a sustentabilidade de sistemas agrícolas baseados na produção de soja. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTCyclic voltammetry (CV) was used to study the oxidation/reduction process of soybean secondary metabolites, free or complexed with Cu (II), at a hanging mercury drop electrode (HMDE) and at a glassy carbon electrode (GC). Three electrodes (HMDE, GC and graphite electrodes) and three different voltammetric techniques (adsorptive cathodic stripping voltammetry (CAdSV), adsorptive stripping voltammetric (AdSV) and differential pulse voltammetry (DPV)) were used to develop ten methods of soybean secondary metabolities analysis. Two of these developed methods were used to analyze a soybean pharmaceutical formulation, four isoflavone known samples and leaves and seeds of four soybean cultivars. In the study of the oxidation/reduction process of isoflavones at GC electrode, irreverible peaks, which correspond to the oxidation of 4’-hydroxy group of B ring, were observed. For rutin, two peaks were observed at GC electrode, a reversible one which corresponds to the oxidation of 3’, 4’-dihydroxy group of B ring and a irreversible one which corresponds the 5,7-dihydroxy group of A ring. A quasireversible reduction peak was observed in the study of the oxidation/reduction process of Cu2+-rutin complex at HMDE. The first developed method, which is based on the accumulation of the Cu(II)-rutin complex at HMDE, presented a detection limit in the order of 10-9 mol L-1 and it was applied on the determination of rutin in seeds and leaves of four soybean cultivars. Rutin was not detected in the seeds of P98R62, BRQ 96-3065 and Dowling and in the leaves of Downling. However, for IAC 100 soybean cultivar, this flavonoid was detected with a concentration value of 0.197 mg g-1. The recovery of added rutin ranged from 94 to 105%, indicating the absence of matrix effect. The second developed method, which is based on the oxidation of isoflavones at GC electrode, presented a detection limit in the order of 10-7 mol L-1 and it was applied on the determination of total isoflavones in four known samples, in a soybean pharmaceutical formulation and in the seeds of a soybean cultivar (Flora). For known samples, the smallest error was obtained for those in with isoflavone composition are similar to soybean fermented products. These results indicate that it is necessary to have an acid hydrolysis process during the preparation of soybean samples, in order to minimize the interference of glycosylated forms. The total concentration of isoflavones in pharmaceutical soy 31.44 mg tablet-1, with relative error of less than 10% when compared to the label value. In the determination of total isoflavones in Flora, a solid phase extraction was performed in order to remove interfering compounds and an average concentration of total isoflavones was found to be 0.184 mg g-1. This obtained value is close to that found for three soybean genotypes which were grown in Londrina (PR).The recovery of added daidzein or genistein indicates the absence of matrix effect. The results obtained in the determination of rutin and total isoflavones in soybean cultivars using the developed voltammetric methods may be applied in integrated pest management and breeding programs, contributing for the sustainability of agricultural systems based on soybean production