Post-hacthing culture of in vitro produced bovine embryos : morphologic and molecular aspects

Tese (Doutorado)—Universidade Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2012.A avaliação de embriões produzidos in vitro (PIV) no estágio pós-eclosão é uma importante ferramenta para verificar a qualidade de embriões PIV. É justamente nessa fase, em que ocorre a maior perda embrionária. Para avaliar os embriões nesse estágio, esse trabalho propõe a utilização do sistema de cultivo pós-eclosão (PHD). Esse sistema é um método alternativo que pode auxiliar na avaliação do potencial de desenvolvimento dos embriões sem a necessidade de transferi-los para receptoras. Mas, para utilizar esse sistema na rotina é necessário verificar sua eficiência. Portanto, esse trabalho teve por objetivo avaliar a viabilidade do sistema PHD através de avaliações morfológicas e moleculares de embriões produzidos nesse sistema. Esse trabalho foi composto de três estudos. O primeiro visou validar o sistema PHD no laboratório e verificar o melhor protocolo para realizar esse sistema. Para isso, túneis de agarose foram construídos com água Milli-Q ou com solução fosfato salina (PBS) foram utilizados para o desenvolvimento dos embriões PIV. O segundo trabalho, após a escolha do melhor protocolo, objetivou avaliar o comportamento de embriões produzidos in vivo e in vitro de D7 cultivados no sistema PHD até D14. E finalmente, o último trabalho, verificou a eficiência do sistema PHD para o cultivo de embriões PIV até D14 comparado à transferência múltipla para o útero de receptoras. Durante o período de cultivo, os embriões foram mensurados e avaliados quanto à qualidade morfológica do trofoblasto e botão embrionário. Além disso, o perfil molecular foi avaliado pela quantificação da expressão de genes relacionado com qualidade do embrião, SLC2A1, SLC2A3, G6PD, PGK-1, KRT8, PLAC 8, CD9, HSF-1, MNSOD , HSP70, IFNT, nos embriões de D7 e D14. Quanto ao primeiro trabalho observou-se que o melhor protocolo para o sistema PHD foi quando se utilizou a água Milli-Q para a construção dos túneis, pois nesse os embriões tiveram um maior crescimento durante o cultivo. No segundo, trabalho verificouse que apesar da baixa taxa de crescimento os embriões in vivo tiveram desenvolvimento semelhante no sistema PHD do que os in vitro. E quando se comparou os embriões totalmente in vitro com os totalmente in vivo, verificou-se que os in vitro eram menores, mas a maioria da expressão dos genes foi semelhante entre os grupos (SLC2A3, PGK-1, KRT8, PLAC 8, CD9, HSF-1, MNSO , IFNT). E, no último trabalho, o principal resultado foi que os embriões in vitro cultivados até D14 no útero de receptoras foram semelhantes ao grupo controle (totalmente in vivo), mas esses dois tipos de embriões foram diferentes dos cultivados no sistema PHD, principalmente, em relação à porcentagem de embriões crescidos/recuperados, ao tamanho e a expressão gênica. Porém, verificou-se a possibilidade de embriões PIV se desenvolverem nos túneis de agarose. Concluiu-se que o sistema PHD ainda não está apto para se utilizado na rotina, principalmente, devido à baixa porcentagem de embriões que se desenvolvem. Portanto, investimentos em métodos para que ele se torne menos seletivo e dê condições para o desenvolvimento de embriões de boa qualidade que se desenvolveria normalmente em ambiente uterino seriam de grande valia. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe evaluation of in vitro-produced embryos (IVP) in the post hatching stage is an important tool to verify the quality of IVP embryos, as is in this phase that most embryonic loss occurs. In the order to evaluate the embryos at this developemental stage, the present study proposes the use of the post-hatching development (PHD) system. This system is an alternative method which may help to evaluate the developmental potential of embryos without transfering them to a recipient’s uterus. However, to use this system routinely in the laboratory, it is necessary to verify its efficiency. Therefore, this study aimed to evaluate the viability of the PHD system using morphological and molecular evaluations of embryos produced in this system. This study was conducted in three different studies. The first was designed to validate the PHD system in the laboratory and to determine the best testing protocol. Agarose tunnels were subsequently constructed either with Milli-Q water or with phosphate buffer saline (PBS) and IVP embryo development was evaluated. Sencondly, after selecting the best protocol, we aimed to evaluate the behavior of in vivo and in vitro embryos in the PHD system from Day (D)7 through D14. Finally, in the third study, we verified the efficiency of the PHD system and multiple transfer protocol for culture IVP embryos until D14. During the culture period, embryos were measured and evaluated for morphological quality of the embryonic trophoblast and embryonic disc. The molecular profile was determined by quantification of the expression of genes related to embryo quality, such as SLC2A1, SLC2A3, G6PD, PGK-1, KRT8, PLAC 8, CD9, HSF-1, MNSOD, HSP70, IFNT, in D7 and D14 embryos, using qPCR. In the first study, we concluded that the best protocol was when agarose tunnels were constructed with Milli-Q water, as embryos demonstrade a greater increase in size. In the second study, we found in vivo embryos presented a lower development rate in the PHD system, when compared morphologically to the in vitro embryos. On comparison of the completely in vitro embryos with completely in vivo embryos, it was found that in vitro embryos were smaller than the in vivo embryos, but most of the genes had similar expression between the groups (SLC2A3, PGK-1, KRT8, PLAC 8, CD9, HSF-1, MNSOD, IFNT). In the last study, we concluded that IVP embryos cultured until D14 in a recipients uterus were similar to control group (completely in vivo), and both were different from embryos cultured in the PHD system. Although the PHD system is inefficient we demonstrated that it can be used to develop IVP embryos. It was concluded that the PHD system is not yet able to be routinely used, especially due to the low percentage of embryos that develop in it. Therefore, an investment into this method, it can become less selective and provide conditions for the develop of good quality embryos that would normally development in uterine conditions, would be of great value