Isolamento e caracterização de promotores órgão-específicos de plantas de soja (Glycine max)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012.A planta de soja (Glycine max [L.] Merr) destaca-se mundialmente pela diversidade de produtos que proporciona para uso animal e humano. No Brasil, a soja é o produto que mais gera divisas cambiais atualmente. No entanto, a produtividade dessa cultura é afetada por diversos fatores bióticos e abióticos. No melhoramento da soja, a engenharia genética tem sido utilizada como ferramenta para geração de novos cultivares capazes de superar essas adversidades. Nessa técnica, o uso de promotores órgão-específicos em detrimento de promotores constitutivos para expressar transgenes restringe sua expressão temporal e espacialmente, aumentando a biossegurança e estabilidade do sistema. Neste trabalho utilizamos dados transcriptômicos e genômicos de domínio público para identificar genes órgão-específicos de soja, isolar e caracterizar suas regiões promotoras. Os genes GmSulfT1 e GmCit1 foram identificados por meio de análises in silico em três bancos de ESTs de soja: GenoSoja, Unigene e da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Esses genes foram selecionados para validação biológica por apresentarem o perfil de EST órgão-específico em pelo menos dois dos bancos citados e pelo ineditismo. Seus perfis de expressão foram avaliados por RT-PCR semiquantitativa e Northern blot. O GmSulfT1 apresentou expressão preferencial em raiz e semente e o GmCit1, por sua vez, em folha de plantas de soja. As regiões promotoras desses genes foram identificadas no genoma da soja cv. Williams 82 e analisadas in silico para identificação de motivos putativos de elementos cis regulatórios. Iniciadores desenhados baseados nessas sequências foram capazes de amplificar fragmentos dessas regiões do genoma da soja cv. Conquista por PCR. Os promotores derivados de deleções da região promotora de GmSulfT1, PSulft0,5 e PCit0,4, PCit0,8 e PCit1,9, de GmCit1, foram clonados a montante do gene repórter gus em vetor binário utilizando o sistema Gateway®. Plantas de fumo (Nicotiana tabacum) foram transformadas para caracterização in vivo dos promotores. No ensaio histoquímico, o gene gus sob regulação dos promotores PSulfT0,5, PCit0,8 e PCit1,9 apresentou altos níveis de expressão em raízes e folhas, enquanto o PCit0,4 preferencialmente em folha. PCit0,4 isolado no presente trabalho poderá ser utilizado futuramente para conferir expressão preferencial em folhas de transgênicos. O caráter de alta expressão de gus em mais de um órgão atribuído por PSulfT0,5, PCit0,8 e PCit1,9, pode, da mesma forma, ser explorado para expressão de transgenes em plantas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe soybean plant (Glycine max [L.] Merr) is a worldwide important crop due to the diversity of products that it provides for animals and humans. In Brazil, the soybean is currently the commodity that generates most of its foreign-exchange reserves. However, the productivity of this crop is reduced by several biotic and abiotic factors. In soybean breeding, genetic engineering has been successfully applied to generating new cultivars able to overcome these adversities. In this technique, the use of organ-specific instead of constitutive promoters restricts the transgene expression temporally and spatially, increasing biosafety and the stability of the system. In this work we used transcriptomic and genomic data of public domain to identify soybean organ-specific genes, isolate and characterize their promoter region. Genes GmSulfT1 and GmCit1, were in silico identified in three ESTs databases, GenoSoja, Unigene and from Embrapa Genetic Resources and Biotechnology. These genes were selected for further analysis due to their organ specific EST profile in at least two of the mentioned database, and novelty criteria. Their expression profiles were biologically validated by semiquantitative RT-PCR and Northern blot assays. GmSulfT1 was preferentially expressed in roots and seeds and GmCit1 in leaves of soybean plants. The promoter regions of these two genes were identified in the soybean cv. Williams 82 genome sequence and in silico analyzed to detect putative motifs of cis regulatory elements. Primers designed based in those sequences were able to amplify fragments of the promoter regions of GmSulfT1 and of GmCit1 by PCR with soybean cv. Conquista genomic DNA. The deleted promoters derived from GmSulfT1 promoter region, PSulft0.5, and from GmCit1, PCit0.4, PCit0.8 and PCit1.9, were fused with the reporter gene gus in a binary vector using the Gateway® System. Tobacco plants were transformed in order to in vivo characterizing these promoters. Histochemical assay showed high gus expression in roots and leaves under control of PSulfT0.5, PCit0.8 and PCit1.9, and under control of PCit0.4, more in leaves. PCit0.4, isolated in the present work, can be used hereafter to activate transgene expression preferentially in leaves. The high expression levels in more than one organ obtained using the other promoters isolated in this work can also be explored to express transgenes in plants