Atividade anticonvulsivante do Ppnp 7, um neuropeptídeo isolado da peçonha da vespa social Polybia paulista

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012.A epilepsia é um distúrbio neurológico complexo, manifestado por aproximadamente 50 milhões de pessoas no mundo, e 90% destas estão em países em desenvolvimento. Para o tratamento dos diferentes tipos de epilepsia, existem no mercado diversos fármacos, porém muitos destes geralmente são caros, apresentam limitações e produzem efeitos colaterais, e assim reduzem a qualidade de vida do paciente. Portanto, o desenvolvimento de novos fármacos é importante, e, neste contexto, os compostos neuroativos isolados da peçonha de artrópodes e, em especial, de vespas, são um recurso em potencial, pois atuam com afinidade e especificidade nas funções sinápticas excitatórias e inibitórias de mamíferos. O objetivo desta pesquisa foi identificar um peptídeo anticonvulsivante na peçonha de Polybia paulista. Vespas foram coletadas no Distrito Federal após obtenção de licença de coleta e manutenção. Glândulas e reservatórios de peçonha foram homogeneizados em água deionizada e acetonitrila 1:1 e centrifugados, e o sobrenadante foi ultrafiltrado com um filtro de até 3000 Da, para a obtenção dos compostos de baixa massa molecular (CBMM-Pp). Para a separação dos CBMM-Pp, foi realizada a cromatografia líquida de alta eficiência em uma coluna de fase reversa semipreparativa (RP-HPLC). A fração com atividade anticonvulsivante foi recromatografada em coluna analítica, e o neuropeptídeo, Ppnp7, foi submetido à espectrometria de massa MALDI TOF/TOF para obtenção da massa molecular, da sequência de aminoácidos e do grau de pureza. Ratos Wistar (Rattus norvegicus) foram submetidos a um procedimento para implantação de uma cânula no ventrículo lateral, para injeção via i.c.v. Para a avaliação da atividade anticonvulsivante, foi utilizado o modelo de indução química aguda de crises epilépticas por meio do convulsivante pentilenotetrazol (subcutânea, 105 mg/kg). Foram registradas a ocorrência de e a latência para o início da crise epiléptica máxima. A avaliação de possíveis alterações na atividade geral espontânea dos ratos foi realizada por meio do bioensaio do campo aberto, enquanto a avaliação de um possível comprometimento motor foi feita por meio do bioensaio do rotarod. O Ppnp7 isolado da fração neuroativa foi sequenciado, e a estrutura primária apresenta nove resíduos de aminoácidos. Curvas de proteção contra a crise epiléptica máxima foram obtidas a partir da utilização de três doses dos CBMM-Pp (350, 210 e 70 µg/animal) e do Ppnp7 (4,5, 3 e 1,5 µg/animal) (p<0,05). Houve também um aumento significativo da latência para o início desta crise (p<0,05). O Ppnp7 não provocou alterações na atividade geral espontânea nem comprometimento motor. Portanto, esta pesquisa demonstrou como compostos isolados da peçonha de vespas sociais, pouco explorados até o momento, podem ser importantes recursos na busca por novos fármacos e na compreensão de distúrbios neurológicos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTEpilepsy is a complex neurological disorder, manifested by approximately 50 million people worldwide (90% are in “developing” countries). For the treatment of this disorder, there are several drugs available, but most of them are expensive, have limitations and produce side effects, reducing the quality of life of patients. Therefore, the development of new drugs is important, and, in this context, the neuroactive compounds isolated from the venom of arthropods, and in particular wasps, are a potential resource because they act with affinity and specificity in excitatory and inhibitory synaptic functions in mammals. The purpose of this study was to identify an anticonvulsant peptide in the venom of Polybia paulista. Wasps were collected in Distrito Federal, Brazil, after obtaining a license for collection and maintenance. Venom glands and reservoirs were homogenized and centrifuged, and the supernatant was ultrafiltered (<3000 Da), to obtain the low molecular weight compounds (LMWC-Pp). For separation of LMWC-Pp, the high performance liquid chromatography was performed on a reversed-phase semipreparative column (RP- HPLC). The anticonvulsant fraction was rechromatographed on an analytical column, and the neuropeptide, Ppnp7, was subjected to MALDI TOF/TOF mass spectrometry to obtain the molecular mass, the amino acids sequence and the purity degree. Wistar rats (Rattus norvegicus) underwent a procedure for implantation of a cannula in the lateral ventricle, for i.c.v. injection. To evaluate the anticonvulsant activity, the model of acute seizures induced by pentylenetetrazole was used (subcutaneous, 105 mg/kg). Occurrence and latency of the maximum seizure were recorded in the bioassays. To evaluate possible changes in spontaneous general activity of rats, the open field bioassay was performed, and to evaluate the possible motor impairment, the rotarod bioassay was used. The Ppnp7 isolated from the neuroactive fraction was sequenced, and the primary structure contains nine amino acid residues. Curves of protection against the maximum seizure were obtained with three different doses of the LMWC-Pp (350, 210 e 70 µg/animal) and of the Ppnp7 (4.5, 3 e 1.5 µg/animal) (p<0.05). There was also a significant increase in the latency to seizure onset (p