Expression profile of candidates genes for the acquisition of competence during oocyte growth in bovine

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011.O objetivo do presente estudo foi estudar o perfil da expressão de genes candidatos para a aquisição da competência durante o crescimento ovocitário em bovinos utilizando ovócitos de diferentes tamanhos provenientes de várias categorias de folículos. Os genes candidatos foram selecionados por estarem possivelmente envolvidos com a aquisição da competência (BMP15, OOSP1, H1FOO, H2A, H3A, H4, SLBP, DNMT1, DNMT3B, HAT, HDAC e SUV39H1). Para determinar o tamanho dos ovócitos a serem utilizados, foi realizado um pré- experimento, em que os folículos pré-antrais foram classificados orfologicamente, agrupados em diferentes categorias em primordial, primário, secundário inicial e secundário final. Após a classificação, os ovócitos de cada folículo foram individualmente isolados e medidos. Folículos pré-antrais e antrais foram isolados de ovários de vacas Nelore (Bos taurus indicus), por dissociação mecânica utilizando o Tissue Chopper. Para o isolamento dos ovócitos, os folículos foram expostos à colagenase tipo II (0,5 mg/ml) e então submetidos a sucessivas pipetagens. Os ovócitos foram medidos através do programa Motic images Plus 2.0 e classificados de acordo com seu diâmetro nas seguintes categorias: 1) ovócitos de folículos primordiais: diâmetro de até 20 μm; 2) ovócitos de folículos primários: 25 a 35 μm; 3) ovócitos de folículos secundários iniciais: 40 a 60 μm e 4) ovócitos de folículos secundários finais; 65 a 85 μm. Para a obtenção dos ovócitos oriundos de folículos antrais incompetentes e competentes, foram utilizadas as medidas de 100 a 120 μm e acima de 128 μm respectivamente. O RNA total foi extraído de 4 pools de 25 ovócitos, de cada categoria de folículo, e os transcritos dos genes foram quantificados por qPCR. Os valores de expressão dos genes alvos foram normalizados pela expressão do gene constitutivo CYC A. Os resultados foram analisados através do teste não paramétrico Kruskall Wallis, para comparar os tamanhos de folículos e ovócitos e avaliar o efeito do tamanho do ovócito na quantidade de expressão gênica. O nível de significância considerado foi P<0,05. Os resultados mostraram que os transcritos da H2A, H3, H4 e SUV39H1 não diferiram (P>0,05) entre os grupos de ovócitos de folículos antrais e pré-antrais. A expressão da OOSP1, SLBP, BMP15, H1FOO, DNMT1, DNMT3B e HAT foram menores (P<0,05) em ovócitos préantrais quando comparados com os de folículos antrais. A H3A foi o único gene em que foi detectado a expressão de RNAm em ovócito de folículo primordial. De todos os genes estudados, apenas a HDAC apresentou diferença significativa entre ovócitos de folículos antrais competentes e incompetentes. Os resultados sugerem que o acúmulo dos estoques dos genes analisados ocorre antes do estágio final da folículogênese e provavelmente não são marcadores para a competência. A HDAC foi o único gene que pode estar relacionado à competência do ovócito, pois mostrou uma diminuição (P<0,05) no nível de transcrito nos grupos de ovócitos competentes quando comparados com o grupo de antrais iniciais (1a 3mm). ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe aim of this present study was investigate the expression profile of candidates genes for the acquisition of competence during oocyte growth in bovine using oocytes from different sizes obtained from several follicle categories. The candidate genes were selected to be possibly involved in competence (BMP15, OOSP1, H1FOO, H2A, H3A, H4, SLBP, DNMT1, DNMT3B, HAT, HDAC e SUV39H1). A pre-experiment was conducted to classify the follicles according to their categories in primordial, primary, small secondary and final secondary follicles. Then the oocytes were individually isolated and measured. Preantral and antral follicles were isolated from ovaries of Nelore (Bos taurus indicus) cows by mechanical dissociation using a Tissue Chopper. To isolate the oocytes, follicles were exposed to collagenase type II solution (0.5 mg/ml) and then submitted to successive pipetting. The oocytes were measured with Motic Images Plus 2.0 program and classified according to their diameter into the following categories: 1) oocytes from primordial follicle: diameter < 20 μm; 2) oocytes from primary follicles: 25 to 35 μm; 3) oocytes from small secondary follicles: 40 to 60 μm; 4) oocytes from final secondary follicles: 65 to 85 μm; 5) oocytes from early antral follicles: 100 to 120 μm; and 6) oocytes from final antral follicles: > 128 μm. Total RNA was extracted from 4 pools of 25 oocytes from each category of follicles using Rneasy Plus® kit, subjected to reverse transcription reaction and genes quantified by qPCR. Target gene expression was normalized using CYC A. Data were analyzed using Kruskal-Wallis test for values which were not normally distributed. Level of significance was considered P<0.05. The results show that the transcripts of H2A, H3A, H4 e SUV39H1 did not differ significantly between groups, showing the same pattern from preantral to antral follicles. For OOSP1, SLBP, BMP-15, H1FOO, DNMT1, DNMT3B and HAT, the pattern of expression was lower in oocytes from preantral follicles when compared to antral follicles. The H3A was the only gene in which expression was detected in oocytes from primordial follicles. From all the studied genes, only HDAC differed significantly between incompetent and competent oocytes. These results suggest that the stocks of transcripts of the studied genes are accumulated before the final phase of folliculogenesis. The HDAC was the only gene in which expression could be related to oocyte competence since it showed a decrease (P