Caracterização química e farmacológica de componentes bioativos da peçonha da aranha caranguejeira Guyruita cerrado

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, 2011.A peçonha de aranhas representa um enorme reservatório de componentes capazes de exibir propriedades que os tornam potenciais ferramentas na investigação de moléculas bioativas visando à compreensão de sistemas biológicos e avanços biotecnológicos. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização química e farmacológica de componentes bioativos presentes na peçonha da aranha Guyruita cerrado. O fracionamento por RP-HPLC da peçonha bruta de machos e fêmeas resultou na eluição de 28 e 38 frações cromatográficas, respectivamente. As análises em RPHPLC e espectrometria de massa permitiram observar que existem diferenças qualitativas e quantitativas dos componentes moleculares entre os gêneros de G. cerrado. As análises descritas a seguir foram realizadas apenas com a peçonha de fêmea. Por sistemas (MALDI TOF/TOF MS e ESI/MALDI – SYNAPT) foram detectados 274 componentes de massa molecular distintos. Destes, foi possível a purificação de duas proteínas de cerca de 42 kDa com atividade hialuronidásica e de sete peptídeos. As sequências primárias completas e/ou parciais foram elucidadas por meio da combinação das técnicas de degradação de Edman, MALDI-ISD e MALDIPSD. A sequência primária parcial do peptídeo Gc24/25.1 revelou similaridade de 60 - 65% com toxinas inseticidas de aranhas caranguejeiras. Foi possível a determinação da sequência primária completa de Gc32.1, Gc32.3, Gc33.1 e parcial de Gc32.2. Esses peptídeos apresentaram similaridade de 48 – 66% com neurotoxinas de canais para potássio de aranhas caranguejeiras. Os peptídeos Gc32.2, Gc32.3 e Gc33.1 foram renomeados de GcTx1, GcTx2 e GcTx3, respectivamente. Também foi realizada a modelagem molecular de GcTx2 e GcTx3 usando a hanatoxina como molde. O modelo proposto para esses peptídeos revelou uma estrutura αββ ligadas por três pontes dissulfeto e comportamento estável na simulação em ambiente solvatado por água. Através da técnica whole-cell patch clamp foi verificado que GcTx1-3 (3 μM) provocaram aumento da condutância das correntes de saída K+ em cardiomiócitos de camundongos. Dessa forma, é possível supor que a diversidade de compostos bioativos encontrados na peçonha da aranha caranguejeira Guyruita cerrado pode corroborar para buscas por novos fármacos e para a ampliação de pesquisa da biodiversidade de aranhas caranguejeiras do Cerrado brasileiro. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe venom of spiders presents a huge reservoir of compounds able to exhibit properties that become a potential tool for investigation of bioactive molecules looking for an understanding of biological systems and biotechnological advances. Given this, the objective of this work performed a chemical and pharmaceutical characterization of the bioactive components present in Guyruita cerrado venom. The fractionating by RPHPLC from the male and female whole venom resulted in 28 and 38 chromatographic eluted fractions respectively. The analysis on RP-HPLC and mass spectrometry showed qualitative and quantitative differences of the molecular mass components between G. cerrado genera. The forward analyses were performed for female venom. 274 components with different molecular masses were using two MS systems (MALDI TOF/TOF MS and ESI/MALDI – SYNAPT). From these, two proteins with approximately 42 kDa with hyaluronidase activity and 7 peptides were purified. The primary sequences were elucidated by a combination of Edman, MALDI-ISD and MALDI-PSD degradation techniques. The partial primary sequences of the peptide Gc24/25.1 revealed a similarity between 60-65% to insecticide toxins from tarantula spiders. It was achieved the complete primary sequences determination of Gc32.1, Gc32.3, Gc33.1 and partial primary sequence resolution of Gc32.2. These peptides had 48-66% of similarity to tarantula spiders neurotoxins that affects potassium channels. The peptides Gc32.2, Gc32.3 and Gc33.1 were renamed GcTx1, GcTx2 and GcTx3 respectively. The molecular modeling of GcTx2 and GcTx3 was done using hanatoxin as template. The mold of peptides showed an αββ structures linked by three disulfide bonds and stable behavior in simulation in a water solvated environment. The GcTx1-3 (3 μM) were assayed using the whole-cell patch clamp technique and cause an increase on the current conductance of K+ in mouses cardiomyocites. On this way, it’s possible to suppose that the diversity of the bioactive compounds found in tarantula spiders Guyruita cerrado venom can collaborate to searches for new drugs and to the expansion the biodiversity research of tarantula spiders in Brazilian Cerrado