Influência do montelucaste sobre o estado de ativação dos eosinófilos e função dos fagócitos em crianças asmáticas

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010.A asma é uma das doenças crônicas mais comuns na infância e sua prevalência e gravidade vem aumentando em várias partes do mundo nos últimos anos. A principal característica da asma é a inflamação das vias aéreas inferiores, responsável pela hiperresponsividade brônquica e limitação variável ao fluxo aéreo, reversível com ou sem tratamento. Várias células desempenham papel importante neste processo inflamatório como os eosinófilos, neutrófilos e monócitos. Na asma, os leucotrienos estão implicados em múltiplos mecanismos fisiopatogênicos incluindo: hipersecreção de muco, aumento da permeabilidade microvascular, prejuízo na atividade ciliar, recrutamento de células inflamatórias, edema e disfunção neuronal. Foi demonstrado que o montelucaste, antileucotrieno, é capaz de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias, diminuir a quimiotaxia e a meia-vida dos eosinófilos. Entretanto, falta ainda um maior esclarecimento da influência do montelucaste sobre a ativação dos eosinófilos e funções dos monócitos e neutrófilos em indivíduos asmáticos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do montelucaste sobre o estado de ativação dos eosinófilos e sobre a capacidade fagocitária de neutrófilos e monócitos e produção de radicais livres, em crianças com asma persistente. Foram selecionadas 83 crianças asmáticas que foram alocadas, aleatoriamente, para receber tratamento com montelucaste ou placebo, por 12 semanas, e 10 crianças controles sadias, das quais foram retirados de 1 a 10 ml de sangue periférico, após consentimento informado. O estado de ativação dos eosinófilos do sangue periférico foi avaliado por parâmetros morfológicos após aderência destas células à lâmina, antes e após 12 semanas de tratamento com o montelucaste ou placebo. Os seguintes parâmetros morfológicos foram quantificados: eosinófilos normais, espraiamento, arredondamento, presença de pseudópodes localizados e generalizados, emissão de grânulos de pequena, moderada e grande quantidade, presença de vacúolos, presença de grânulos isolados, degeneração celular e comunicação celular. Quanto aos fagócitos, tanto a capacidade fagocitária dos neutrófilos e monócitos pelos receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) quanto pelos receptores para opsoninas foram analisados. O índice fagocitário foi determinado pela multiplicação da média de Saccharomyces cerevisiae aderidas/ingeridas por fagócito pelo percentual de fagócitos envolvidos na fagocitose. A avaliação da capacidade oxidativa dos fagócitos foi feita pelo teste do nitroblue tetrazolium. Observamos que o número de eosinófilos com aspecto normal no sangue periférico apresentava correlação inversa com a gravidade do quadro asmático, enquanto que a emissão de pseudópodes generalizados e grânulos isolados mostravam correlação positiva com a gravidade da asma. O tratamento com o montelucaste foi capaz de diminuir o número de eosinófilos no sangue periférico, aumentar a proporção de eosinófilos com aspecto normal e diminuir a proporção de eosinófilos arredondados e a liberação de grânulos isolados após 12 semanas do tratamento com montelucaste, quando comparado ao grupo placebo. Quanto à capacidade de redução do corante NBT, não houve diferença entre os indivíduos asmáticos e controles sadios antes de iniciar o tratamento, porém observamos que os asmáticos reduziam o NBT de forma mais intensa que os sadios. Após 12 semanas de tratamento com o montelucaste, houve uma diminuição do potencial de redução forte em ambos os grupos tratados com placebo ou montelucaste. Observou-se menor índice fagocitário dos neutrófilos para receptores que reconhecem padrões moleculares de patógenos nos indivíduos asmáticos quando comparado ao controle. E o montelucaste apenas diminuiu o índice fagocitário dos monócitos para receptores de opsoninas quando comparado ao placebo. Mostramos, de forma inédita, que o montelucaste é capaz de alterar os parâmetros de ativação dos eosinófilos correlacionados com a gravidade clínica e que este método utilizado para avaliar a ativação dos eosinófilos é acurado, de fácil realização e pode ser um marcador do processo inflamatório da asma e poderia ser utilizado para o acompanhamento do tratamento de indivíduos com asma. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACTAsthma is one of the most common chronic diseases in childhood and its prevalence and severity are increasing in many parts of the world in recent years. The main characteristic of asthma is inflammation of the lower airways, responsible for bronchial hyperresponsiveness and variable airflow limitation, reversible with or without treatment. Several cells play an important role in inflammation as eosinophils, neutrophils and monocytes. In asthma, the leukotrienes are implicated in multiple physiopathological mechanisms including mucus hypersecretion, increased microvascular permeability, impaired ciliary activity, recruitment of inflammatory cells, edema and neuronal dysfunction. It was shown that montelukast, antileukotriene, is able to inhibit the production of proinflammatory cytokines, decreasing chemotaxis and half-life of eosinophils. However, the influence of montelukast on the activation of eosinophils and phagocytic functions of monocytes and neutrophils in asthmatic subjects are not clear yet. Therefore, the objective of this work was to evaluate the effect of montelukast on the state of activation of eosinophils, the phagocytic capacity of neutrophils and monocytes and the production of free radicals by phagocytes in children with persistent asthma. It was selected 83 asthmatic children that were randomly assigned to treatment with montelukast or placebo for 12 weeks and 10 healthy control children. Peripheral blood (1 to 10 ml) was taken from the children after parents informed consent. The state of activation of peripheral blood eosinophils was assessed by their morphological parameters after adherence to slide, before and after 12 weeks of treatment with montelukast or placebo. The following morphological parameters were evaluated: normal eosinophils, spreading, rounding, presence of localized and generalized pseudopods, release of small, moderate and large quantity of granules, cytoplasmatic vacuoles, cluster of free eosinophils granules, cell degeneration and cell communication. The monocyte and neuthrophil phagocytic capacity were assessed through pathogen-associated molecular patterns receptors (PAMPr) and through opsonin receptors. The phagocytic index was calculated as the average number of ingested Saccharomyces cerevisiae per phagocyte multiplied by the percentage of cells engaged in phagocytosis. The oxidative capacity was assayed by the nitroblue tetrazolium (NBT) test. The number of eosinophils with normal feature in peripheral blood showed an inverse correlation with the severity of asthma, while the emission of widespread pseudopods and isolated granules showed positive correlation with the severity of asthma. Treatment with montelukast was able to reduce the number of eosinophils in peripheral blood, and to increase the proportion of eosinophils with normal feature. The drug was also able to decrease the proportion of eosinophils with rounded feature and that releasing free eosinophil granules after 12 weeks of treatment compared to placebo. There was no difference in the percent reduction of NBT dye between asthma individuals and healthy controls before starting treatment, but individuals with asthma showed a stronger reduction of NBT than the healthy one. After 12 weeks of treatment with montelukast, there was a decrease in the power of reduction in both groups treated with placebo or montelukast. The neutrophil phagocytic index through pathogen-associated molecular patterns receptors in asthma individuals was lower than that of healthy control individuals. Montelukast treatment decreased the phagocytic index of monocytes through opsonin receptors when compared to placebo. Our data showed, for the first time, that montelukast is able to modify the activation of eosinophils correlated with clinical severity and that the method used to assess eosinophil activation is accurate, easy to perform and can be a marker of inflammation in asthma, and it could be used to the follow up of treatment of asthma individuals