Atividades amilolíticas identificadas em bibliotecas metagenômicas da microbiota do solo do Cerrado

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010.As amilases são enzimas que degradam o amido e encontram diversas aplicações nas indústrias de alimentos, de bebidas, de detergentes, têxteis e de papel. Esta enzima é produzida por diversos organismos incluindo a microbiota do solo. O solo tem sido uma excelente fonte para o isolamento de microrganismos produtores de novas biomoléculas, entretanto, estima-se que menos de 1% da microbiota do planeta é cultivável em laboratório. Técnicas recentes permitem a extração de DNA total de uma amostra ambiental, seguida da sua clonagem em microrganismos cultiváveis. O Cerrado é o segundo maior bioma da América do Sul sendo que sua biodiversidade é considerada a mais rica dentre regiões similares no mundo. Duas bibliotecas metagenômicas foram construídas a partir da microbiota do solo do Cerrado: uma de grandes insertos (~30 kb) e a segunda contendo pequenos insertos (~7 kb). O objetivo do presente trabalho foi realizar a análise de clones amilolíticos obtidos a partir destas bibliotecas e identificar os genes responsáveis por atividades detectadas em placas. Foi realizada a extração de plasmídio de clones previamente identificados nas duas bibliotecas metagenômicas citadas e estes foram utilizados para realizar a retransformação da célula em que a biblioteca foi construída, para confirmação de fenótipo. Foi realizado ensaio para detecção de atividade dextrinizante em meio líquido com os clones que apresentaram o perfil amilolítico em placa. Os fragmentos de interesse foram diretamente sequenciados ou subclonados para posterior sequenciamento. Foi realizada a montagem e análise das sequências e estas foram comparadas com sequências depositadas no GenBank e submetidas a alinhamentos e análises filogenéticas. Identificou-se em um clone ORF relacionada com a superfamília das α-amilases, com domínios da família Glicosil hidrolase e com similaridade a sequências depositadas do gênero Acidobacterium. O sequenciamento parcial de um segundo clone identificou ORFs que indicam uma relação com o gênero Burkholderia. A utilização de ferramentas metagenômicas permitiu acessar enzimas hidrolíticas presentes na microbiota do solo do Cerrado contornarndo a necessidade do cultivo dos microrganismos para explorar o potencial que este ambiente possui. Portanto, estas ferramentas podem e devem ser utilizadas como forma de identificarmos genes que dificilmente seriam descobertos de outra forma. O presente estudo identificou o gene de uma glicosil hidrolase. Para confirmar a aplicabilidade desta enzima em processos biotecnológicos, será realizada a clonagem do gene de interesse em vetor de expressão apropriado e realização de caracterização bioquímica. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTAmylases are starch-degrading enzymes which encounter several applications in the food, beverage, detergent, textile and paper industries. This enzyme is produced by several organisms including the soil microbiote. The soil has been used as an excellent source of new microorganism that produce novel biomolecules, however, current estimates indicate that less the 1% of the planet’s microorganisms are culturable in laboratory conditions. Recent techniques permit the extraction of total DNA from an environmental sample followed by cloning of its DNA in culturable microorganisms. Cerrado is South America’s second biggest biome and is considered to be the most biodiverse amongst similar regions in the world. Two metagenomic libraries were built from Cerrado’s soil microbiome: one of large inserts, (~30 kb) and another comprising small inserts (~7 kb). The goal of this work was to analyze amylolytic clones detected in these libraries and identify genes responsible for amylytic activity detected on plates. Plasmid extraction from positively identified clones from both libraries was accomplished and plasmids were utilized for retransformation of cells used in library constructions to confirm phenotypes. Liquid dextrinizing assays were performed of clones with positive activity on plates for detection of amylolytic profile. Cloned fragments of interest were either directly sequenced or subcloned and then sequenced. Contigs were assembled, analyzed and compared with sequences in GenBank database as well as used in alignments and phylogenetic analysis. An ORF was identified with similarities to sequences of the amylase superfamily with domains of glycosyl hydrolase family similar to sequences of Acidobacterium. Parcial sequencing of second clone identified ORFs with similarities to sequences of Burkholderia. The use of metagenomic techniques permitted access to hydrolytic enzymes present in Cerrado’s microbiome soil dispensing culturing of microorganisms to explore the potential this environment possesses. Therefore, these techniques can and should be used as a form of identification of novel genes that would difficultly be accessed in another manner. This work identified a glycosyl hydrolase gene. To confirm the applicability of this enzyme in biotechnological processes, cloning of gene in appropriate expression vector and biochemical characterizations will be carried out