Caracterização de genes de virulência de Escherichia coli de adesão difusa (DAEC)

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010.Embora as Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) sejam classificadas como um dos seis grupos de E. coli diarreiogênicas, sua patogenicidade ainda é controversa. Diversas linhagens de bactérias intestinais, incluindo Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri e Salmonella enterica, possuem em seu genoma uma ilha de patogenicidade (PAI) contendo genes que codificam um Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), responsável pela transferência de proteínas efetoras do citoplasma da bactéria diretamente para o citoplasma da célula hospedeira. A presença de genes TTSS é, portanto, um forte indicativo de virulência. Tendo em vista tais informações, este trabalho teve como objetivos a identificação e caracterização de potenciais genes TTSS de isolados de DAEC recuperados de crianças diarréicas. Experimentos de PCR utilizando iniciadores direcionados aos genes TTSS escD, espA, espD, espB e escF resultaram na detecção de sete prováveis genes em três isolados de DAEC. Dentre as sequências obtidas, detectou-se a presença dos genes espA, espB e escF completos em dois desses isolados de DAEC. Análises de identidade desses genes em relação aos homólogos de diversas linhagens de enteropatógenos sugerem que os isolados de DAEC são bastante heterogêneos. Além disso, as identidades dos genes TTSS de DAEC em relação aos homólogos de diferentes linhagens de E. coli enteropatogênicas e enterohemorrágicas são bastante elevadas, podendo atingir 100%. A construção de árvores filogenéticas empregando as sequências desses genes confirmou tais resultados e demonstrou que os isolados C39 e C74 são evolutivamente mais próximos entre si que em relação à DAEC C40, agrupada no mesmo clado da EPEC prototípica E2348/69. Ensaios de transcrição reversa utilizando RNA dos isolados C39 e C74 revelaram ainda que alguns dos possíveis genes consistem em genes de fato, uma vez que são transcritos sob indução. Com a finalidade de verificar a expressão dos genes TTSS de DAEC foram também realizados experimentos de microscopia eletrônica e de microscopia de força atômica, porém, as imagens obtidas por meio dessas técnicas foram inconclusivas. Conjuntamente, os resultados apresentados neste trabalho sugerem fortemente a presença de uma PAI contendo genes TTSS em DAEC, e constituem evidências a favor da patogenicidade desse grupo de E. coli. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTAlthough diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) are classified as one of the six pathotypes of diarrheiogenic E. coli, their pathogenicity is still controversial. Several strains of bacteria, including Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri and Salmonella enterica, possess a pathogenicity island (PAI), containing genes that code for a Type III Secretion System (TTSS), dedicated to inject effector proteins directly from the bacterial cytoplasm into the host cell cytoplasm. Therefore, the presence of TTSS genes is considered a strong evidence of virulence of a given microorganism. This work describes the identification and characterization of potential TTSS genes in DAEC isolates recovered from diarrheic children. PCR experiments using primers targeted to the TTSS genes escD, espA, espD, espB and escF resulted in the detection of seven putative genes in three isolates of DAEC. Among the sequences obtained, it was possible to detect the presence of the complete espA, espB and escF genes in two of the DAEC isolates. Identity analyses of these genes with different strains suggest that DAEC isolates are quite heterogeneous. Moreover, the identities of TTSS genes of DAEC compared to enteropathogenic and enterohaemorrhagic E. coli are very high, sometimes reaching 100%. The construction of phylogenetic trees using the sequences of these genes confirmed these findings and showed that the isolates C39 and C74 are evolutionarily closer to each other than to the C40 DAEC isolate, which was grouped in the same clade of the prototypical EPEC E2348/69. Tests using reverse transcription of RNA isolated from C39 and C74 also revealed that some of the putative genes consist of true genes, since they were transcribed under induction conditions. In order to analyze the expression of TTSS genes in DAEC, electron microscopy and atomic force microscopy experiments were also carried out, however, the images obtained by these techniques were inconclusive. Together, the results obtained in this work strongly suggest the presence of a PAI containing TTSS genes in DAEC, and constitute evidence for the pathogenicity of this group of E. coli