Identificação de um novo Antígeno de Paracoccidioides brasiliensis (Lumazina Sintase) através da Técnica de IVIAT

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006.Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico agente causador da paracoccidioidomicosse (PCM), uma micose que afeta 10 milhões de indivíduos na América Latina. A infecção é adquirida pela inalação de propágulos aéreos produzidos pela forma miceliana do fungo, os quais se convertem à morfologia leveduriforme na temperatura do hospedeiro. P brasiliensis expressa in-vivo importantes genes que podem contribuir para a patogênese do fungo. Nós utilizamos a tecnologia do antígeno induzido in-vivo (IVIAT) para identificar novos genes de P. brasiliensis que podem ser expressos durante o processo de infecção. A técnica IVIAT é uma modificação do rastreamento imunológico que evita o uso de modelo animal e permite a identificação de antígenos expressos em vários estágios da infecção. Nós utilizamos a estratégia de IVIAT para identificar genes possivelmente induzidos in-vivo. Usando esta técnica nós selecionamos proteínas imunogênicas que poderiam ser expressas especificamente durante a infecção e não durante o crescimento sob condições padrões do laboratório. O soro de onze pacientes com PCM obtidos em Goiânia, foram combinados e, em seguida, adsorvidos com extratos de células totais e lisados de células leveduriformes cultivadas in-vitro. Esses soros foram utilizados para rastrear proteínas de uma biblioteca de cDNA da fase leveduriforme de P. brasiliensis construída no vetor ZAPII. Clones foram obtidos e caracterizados. O cDNA que codifica para uma proteína de 174 resíduos de aminoácidos foi caracterizado como lumazina sintase (PbLS) de P.brasiliensis (GenBank: DQ081183). Análises comparativas entre a PbLS e outros organismos foram feitas. Essa proteína catalisa o penúltimo passo na síntese de riboflavina em plantas, fungos e bactérias. Para produzir anticorpos contra a PbLS recombinante, uma construção no pGEX-4T-3-LS foi realizada e introduzida dentro das células de Escherichia coli e a expressão e purificação da proteína recombinante foi obtida. A análise da reatividade imunológica da proteína recombinante mostrou que esta é reconhecida por soros de pacientes com PCM e não é reativa com soros de indivíduos controle. Para analisarmos a expressão do gene Pbls nas duas formas de P.brasiliensis utilizamos a técnica RT-PCR semiquantitativo. Os transcritos para LS foram preferencialmente expressos na forma leveduriforme do fungo. Pneumócitos humanos infectados com P.brasiliensis foram utilizados para investigar a expressão dos transcritos num modelo de infecção. O gene Pbls foi detectado em células de pneumócitos humanos infectados com células leveduriformes. A LS representa um alvo atrativo para o desenvolvimento de drogas contra patógenos, visto que, bactérias, fungos e plantas são dependentes da síntese endógena da vitamina B2. Estudos mostram que a LS recombinante são fortemente imunogênicos e elucidam resposta immune celular e humoral, conferindo proteção em camundongos. Esses dados são muito interessantes e despertam o interesse em se estudar essa proteína do fungo P. brasiliensis. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTParacoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus causing paracoccidioidomycosis (PCM), a mycosis that affects 10 million individuals in Latin America. The infection is acquired by inhaling airborne propagules produced by the fungal mycelium which transforms into the pathogenic yeast form, when at the body temperature. P brasiliensis expresses invivo many important virulence genes that may contribute to the overall fungus pathogenesis. We utilized in vivo-induced antigen technology (IVIAT) to identify new P. brasiliensis antigens that could be expressed during the infection process. IVIAT is a modified immunoscreening that circumvents the need for animal models and permits identification of antigens expressed at various stages of infection. We used the IVIAT strategy to identify P. brasiliensis genes putatively induced in vivo. Using this technique we selected immunogenic proteins which should be expressed specifically during human infection and not during growth under standard laboratory conditions. Sera from eleven patients with PCM infection obtained in Goiânia were pooled and after that were adsorbed with whole cells and lysates of the in vitro cultured yeast phase. These sera were probed to induced proteins from a cDNA expression library of the yeast phase of P. brasiliensis constructed in ZAPII. Clones were obtained and characterized. Of special note is a cDNA (Pbls) encoding a 174 amino acid residues protein characterized as lumazine synthase (PbLS) homologue of P.brasiliensis (GenBank: DQ081183).This protein catalyzes the penultimate step in the synthesis of riboflavin in plants, fungi, and microrganisms. In order to produce antibodies against the recombinant PbLS the expression construct pGEX-4T-3-LS was introduced into Escherichia coli cells and the expression and purification of the recombinant protein was obtained. The analysis of the immunological reactivity of the recombinant protein showed that this is recognized by sera of patients with PCM and is not reactive with sera of control individuals. To analyze the expression of the Pbls gene in the two forms of P.brasiliensis we use semiquantitative RT-PCR. The transcripts for LS had been preferentially expressed in the yeast form of fungus. Human pneumocytes infected with P.brasiliensis had been used to investigate the expression of transcripts in an infection model. The Pbls gene was detected in yeast cells infecting human pneumocytes. The lumazine synthase represents an attractive targets for the development of drugs against pathogens, since bacteria, fungus and plants are dependent of the endogenous synthesis of the B2 vitamin. Studies shown that recombinant lumazine synthase is strongly immunogenic and elicits both humoral and cellular immune responses confering protection in mice. Those data make very interesting the study of this protein in P. brasiliensis