Tipagem molecular e evolução do gênero Paracoccidioides

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008.A PCM é uma micose sistêmica que ocorre em vários países da América Latina, principalmente Brasil, Venezuela e Colômbia e, afeta principalmente indivíduos da população rural. Estudos de variabilidade genética de isolados do Paracoccidioides brasiliensis, utilizando diferentes tipos de marcadores moleculares, já mostraram uma alta variabilidade genética deste patógeno. O isolado Pb01, em especial, diverge das 3 espécies filogenéticas identificadas previamente (S1, PS2, PS3) e sua classificação taxonômica dentro do gênero Paracoccidioides ainda permanece não definida. Neste trabalho, foram identificados mais 16 isolados que apresentaram um genótipo semelhante ao Pb01, por análise de um marcador molecular presente no íntron1 do gene hsp70, os quais foram denominados “Pb01-like”. Utilizando a metodologia do reconhecimento de espécies filogenéticas pela concordância genealógica (GCPSR), este trabalho teve como objetivo investigar a existência de um grupo sistematicamente significante que abrigasse estes isolados do tipo “Pb01-like”, em uma amostragem total de 88 isolados. Para análise filogenética foram utilizados os métodos de máxima parcimônia e análise de Bayes de 13 loci polimórficos, tanto individuais ou concatenados, o que permitiu agrupar estes isolados “Pb01-like” em um grupo filogenético separado das 3 espécies filogenéticas S1, PS2 e PS3. Foi detectado um alto número de polimorfismos fixados entre os dois grupos geneticamente isolados, o que sugere um bloqueio do fluxo gênico entre eles. O evento de especiação do grupo filogenético “Pb01-like” é simpátrico uma vez que compartilha algumas regiões geográficas das outras 3 espécies filogenéticas. Os dois grupos, “Pb01-like” e S1,PS2,PS3, são altamente divergentes e o tempo médio estimado de isolamento genético entre eles foi de 19 milhões de anos atrás. A análise de recombinação possibilitou detectar que o evento de recombinação ocorre dentro das duas populações de forma separada, o que é compatível com o isolamento reprodutivo. De acordo com o critério do método de reconhecimento de espécies filogenéticas pela concordância genealógica (GCPSR) o grupo “Pb01-like” pode ser considerado uma nova espécie filogenética, diferente das três espécies filogenéticas previamente mencionadas (Matute et al., 2006), uma vez que o clado correspondente aos isolados “Pb01-like” aparece fortemente sustentado nas genealogias geradas a partir dos dados de polimorfismo de 13 loci analisados, tanto simples como concatenados, com valores de probabilidade posterior (1.0) e “bootstrap” (100%) altamente significantes. Análise sobre características morfológicas, possibilidade de cruzamento genético, características fenotípicas e da doença (PCM), utilizando isolados representativos dos 2 grupos, se encontram em andamento. Se forem confirmadas as características exclusivas e específicas para cada grupo aqui identificado, em conjunto com os dados de filogenia molecular, isto sustentaria fortemente a descrição formal de uma nova espécie para o gênero Paracoccidioides. e devido a grande relevância deste patógeno na área médica na América Latina seria importante nomear o clado “Pb01-like”. Uma nova nomenclatura pode facilitar a comunicação entre médicos patologistas e pesquisadores da área. Para a espécie filogenética correspondente aos isolados “Pb01-like” sugere-se a descrição formal de uma nova espécie: Paracoccidioides lutzii, em tributo ao médico micologista Adolpho Lutz, que foi o pioneiro a descrever o fungo patogênico humano P. brasiliensis há exatamente 100 anos atrás (1908). _______________________________________________________________________________ ABSTRACTParacoccidioidomycosis is a systemic illness with an area of occurrence covering most of Latin America, with highest prevalence in Brazil, Venezuela and Colombia, and that affects mainly individuals living in the countryside. Studies on difference isolates of the causative agent, Paracoccidoides brasiliensis, have revealed a great degree of genetic variability in this pathogen. The Pb01 isolate, in particular, differs from the three previously described phylogenetic species (S1, PS2 and PS3; Matute et al., 2006) and its taxonomic classification in the genus Paracoccidioides remains undefined. In the present work, sixteen isolates genotypically similar to Pb01 have been identified by analysis of a molecular marker from the first intron of the hsp70 gene; these isolates have been dubbed ‘Pb01-like’. Using the method of recognition of phylogenetic species by genealogic concordance (GCPSR), this work aimed at looking into the existence of a systematically significant group of ‘Pb01-like’ isolates from a total of 88 samples. For phylogenetic analysis the methods of maximal likelihood and Bayesian analysis were applied to thirteen polymorphic regions, including individual and concatenated loci. This allowed the grouping of the ‘Pb01-like’ isolates in a phylogenetic group distinct from S1, PS2 and PS3. A high number of fixed polymorphisms was identified between the ‘Pb01-like’ cluster and that composed of the other three species, which suggests a blockage of all genetic flow between them. The speciation event that defined the new phylogenetic group is sympatric relative to S1 and PS2. The group that includes S1, PS2 and PS3 and the ‘Pb01-like’ cluster are highly divergent and have been genetically isolated for about 19 million years. Recombination analysis revealed that recombination events occur independently inside the two groups, which suggests reproductive isolation. In keeping with GCPSR, the ‘Pb01-like group’ can be considered a new phylogenetic species distinct from the other three, since the clade corresponding to ‘Pb01-like’ isolates is strongly supported by all pedigrees independently generated from polymorphism data of the thirteen loci, with values of posterior probability (1.0) and of bootstrap agreement (100%) highly significant. Further analysis of morphological, phenotypical and pathogenic profiles, and of the possibility of mating, is under way for isolates representative of all species. If exclusive and specific characteristics are identified for the ‘Pb01-like’ group, this would justify, in conjunction with molecular phylogeny data, the formal description of a new species for the genus Paracoccidioides, which would be accompanied by a renaming of the group, in the light of the medical relevance of this pathogen in Latin America. A new nomenclature would obviously ease information exchange among pathologists and researchers. We suggest formally to name the phylogenetic species encompassing the ‘Pb01-like’ clade as Paracoccidioides lutzii, as a tribute to medical mycologist Adolpho Lutz, who first described human pathogen P. brasiliensis exactly one hundred years ago