Effects of low temperature maintenance of ovaries on the morphology of pig primordial follicles : an ultrastructural approuch

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008.O objetivo do presente trabalho foi avaliar a viabilidade de folículos primordiais suínos após período de hipotermia com ou sem cultivo in vitro. A baixa temperatura tem sido usada para reduzir o metabolismo celular e minimizar a degradação tecidual. Foram utilizados 4 ovários de 4 animais prépúberes oriundos de abatedouro. Como controle, pedaços de córtex ovariano foram fixados no abatedouro (Controle Abate) e no momento em que chegaram ao laboratório (Controle Lab). Como controle do cultivo, pedaços de córtex foram destinados ao cultivo in vitro assim que chegaram ao laboratório (Controle CIV). Os ovários foram transportados ao laboratório a 36-38ºC em no máximo 1 hora. No laboratório, pedaços de córtex ovariano foram dissecados e mantidos em solução salina estéril a 4ºC ou 20ºC por 6, 12 ou 18hs. Após o resfriamento de todas as amostras, em cada tratamento houve um fragmento do córtex que foi fixado e outro que foi submetido ao cultivo in vitro por duas horas e então fixado posteriormente. O cultivo in vitro foi realizado utilizando meio Waymouth suplementado com piruvato, glutamina, ITS, ácido ascórbico, antibióticos e soro fetal bovino, a 38ºC em atmosfera umidificada com 5% de CO2 em ar. A finalidade do cultivo in vitro de curta duração foi somente restabelecer a temperatura e o metabolismo celular, não havendo a intenção de promover crescimento, para que as células pudessem expressar morfologicamente possíveis danos moleculares que tenham sofrido durante o tratamento. Após a fixação, todas as amostras foram preparadas para histologia. Somente os folículos primordiais foram contados e classificados como morfologicamente normais (FMN) ou degenerados. Os tratamentos foram comparados entre si por ANOVA e teste de Scheffe’s. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os tratamentos (P>0,05) sob análise de microscopia de luz. É possível preservar ovários suínos a 4ºC ou 20ºC por até 18h, mantendo alta porcentagem de folículos primordiais morfologicamente normais (FMN). Na maioria dos tratamentos pode ser notada uma tendência em aumentar a percentagem de FMN quando o cultivo in vitro foi realizado. O cultivo in vitro não mostrou danos submorfológicos que poderiam ter sido causados durante o período de resfriamento. Os resultados ultra-estruturais mostram que folículos primordiais em tecido ovariano mantido a 4ºC ou 20ºC por 18hs não apresentaram alterações ultra-estruturais que comprometessem sua viabilidade. Além disso, os tratamentos cultivados in vitro por 2h proporcionaram uma melhor integridade celular dos folículos primordiais suínos.The aim of the present study was to evaluate the viability of pig primordial follicles after low temperature maintenance. Four ovaries from 4 gilts collected at a local slaughterhouse were used. As controls, samples of ovarian cortex were fixed at the slaughterhouse (slaughter control) an as soon as they got to the laboratory (LAB control). Also, fresh cortex samples were placed in in vitro culture (CIV control). The ovaries were transported to the Lab at 36-38ºC within 1 hour. In the Lab, samples of ovarian cortex were dissected and maintained in sterile saline solution at 4 ºC or 20 ºC for 6h, 12h or 18h. After the incubation time of all treatments, one sample of each treatment was fixed and another was placed in in vitro culture for 2h and than fixed. The in vitro culture was performed using Waymouth medium supplemented with pyruvic acid, glutamine, ITS, ascorbic acid, antibiotics and fetal calf serum, at 38 ºC inhumidified atmosphere with 5% CO2 in air. The aim of this short in vitro culture was only return the tissues to their normal temperature and metabolism (there was no intention to promote growth). This way, the cells could morphologically express molecular damage that could have occurred during the cooling. After fixation, all samples were processed for histology. Only primordial follicles were counted and classified as morphologically normal (FMN) or degenerated. Treatments were compared among each other using ANOVA and Scheffe’s test. No significant difference was observed among treatments (P>0.05) under the light microscopy analysis. It is possible to preserve pig ovaries at 4ºC or 20ºC for up to 18h, keeping a high percentage of morphologically normal primordial follicles. The most treatments a tendency to improve the percentage of FMN could be noted when in vitro culture was performed. The in vitro culture did not show submorphological damage that could be caused during low temperature preservation. Our results ultrastructural indicate that the treatments in vitro cultured for 2h showed better conditions viability and cellular integrity of pig primordial follicles