Variações do secretoma de trichoderma harzianum em resposta a diferentes fontes de carbono

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009.O fungo filamentoso Trichoderma harzianum conhecido produtor de enzimas extracelulares como xilanases e celulases foi crescido em três fontes de carbono quimicamente definidas, glicose, celulose e xilana e uma fonte complexa, bagaço de cana, a fim de determinar-se as variações que cada uma geraria na atividade enzimática e na composição do secretoma do fungo. A produção enzimática de T. harzianum sobre bagaço de cana foi inicialmente avaliada durante 15 dias, evidenciando pouca variação em termos de concentração, produção de proteínas e perfis eletroforéticos ao longo do tempo. Após crescimento por 9 dias, detectou-se atividade xilanolítica (0,00610 UI/mL) e celulolítica (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) no meio suplementado com glicose, indicando uma possível produção constitutiva das enzimas. A mais alta atividade xilanolítica(0,09514UI/mL) e celulolítica (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) foram observadas quando T. harzianum foi cultivado em meio com bagaço de cana como fonte de carbono. Os secretomas foram submetidos a eletroforese bidimensional (2-DE) em faixa de pH 3-10 que mostrou perfil pouco complexo na amostra do meio com glicose e uma maior concentração de spots protéicos na região ácida dos demais géis. Foram então realizadas eletroforeses 2-DE na faixa de pH 4-7, a fim de obter melhor resolução de spots correspondentes a possíveis isoformas protéicas. Os géis bidimensionais na faixa de 4-7 foram submetidos a análise de imagens para determinar o número total de spots em cada gel assim como os spots exclusivos e os pareados entre as diferentes condições. Tentativas de identificação de spots por peptide mass fingerprinting e MS/MS mostraram baixa porcentagem de sucesso, provavelmente devido ao baixo número de sequências de T. harzianum em banco de dados e a existência de modificações pós-traducionais como glicosilações nas enzimas secretadas. Nacetil-glucosaminidase e α-L-Arabinofuranosidase, foram identificadas no secretoma obtido em meio contendo bagaço de cana. Espera-se que a conclusão dos mapas secretômicos possa contribuir na compreensão dos mecanismos de expressão e secreção de enzimas de T. harzianum e aplicações destas em processos biotecnológicos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe filamentous fungus Trichoderma harzianum recognized producer of extracellular enzymes such as xylanase and cellulases was grown in three chemically defined carbon sources, glucose, cellulose and xylan, and a complex source, sugarcane bagasse, in order to determine the variations in enzyme activity and secretome composition of fungus. The enzyme production of T. harzianum on sugarcane bagasse, was initially evaluated for 15 days, showing little variation in terms of concentration, protein production and electrophoretic profiles over time. After 9 days of growth, xylanolytic (0,00610 UI/mL) and cellulolytic (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) activities were detected in the medium supplemented with glucose, indicating a possible constitutive production of enzymes. The major cellulolytic (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) and xylanolytic (0,09514UI/mL) activities were observed when the T. harzianum was grown in medium with sugarcane bagasse. The secretoms were subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) in pH range 3-10 showed low complex profile in the sample of medium with glucose and a greater concentration of proteic spots in the acidic region of other gels. Electrophoresis were then performed 2-DE in the range of pH 4-7, to obtain greater resolution of spots corresponding to possible protein isoforms. The two-dimensional gels in the range of 4-7 were subjected to computational analysis of images that showed the total number of spots in each gel as well as exclusive and matched spots between the different conditions. Attempts to identify spots by peptide mass fingerprinting and MS / MS showed low percentage of success, probably due to the low number of sequences of T. harzianum in the database and the existence of posttranslational modifications as glycosylation in the secreted enzymes. N-acetyl-glucosaminidase and α-L- arabinofuranosidase, were identified in sugarcane bagasse secretome. It is expected that the conclusion of secretomic maps can contribute to a better understanding of the expression and secretion mechanisms of T. harzianum enzymes and their applications in biotechnological processes