Análise da região promotora dos genes 1,3-ß-glicana sintase e quitina sintase 4 de Paracoccidioides brasiliensis

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009.Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), é um fungo termodimórfico que cresce como micélio à temperatura ambiente e se diferencia para levedura em culturas a 37°C e no tecido do hospedeiro. A transição dimórfica de P. brasiliensis está associada com alterações na parede celular. Quando o fungo se diferencia de micélio para levedura, o conteúdo de quitina é aumentado e a composição de glicana é alterada, reduzindo o conteúdo de 1,3-b-glicana e aumentando o conteúdo de 1,3-a-glicana. Em P. brasiliensis, um homólogo do gene de 1,3-b-glicana sintase (Pbfks1) e seis genes de quitina sintase (Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e Pbchs6) foram identificados. Em nosso estudo, nós investigamos a região promotora dos genes Pbfks1 e Pbchs4. Por meio de ensaio de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA), analisamos sondas referentes aos promotores desses dois genes e identificamos prováveis sítios regulatórios. A análise da região promotora do gene Pbfks1 indica um TATA Box que pode ser funcional, e sugerimos que o promotor do gene Pbchs4 possa estar sendo regulado pelo elemento de resposta ao estresse (STRE). Além disso, demonstramos também que o domínio de ligação ao DNA de PacC de P. brasiliensis reconhece um sítio descrito para PacC de A. nidulans, porém, a proteína não reconheceu uma variação na seqüência consenso presente no promotor do gene Pbchs4. Observamos que uma sonda referente ao promotor do gene Pbchs4 que contém um sítio para o fator de transcrição CreA não interage com o domínio de ligação ao DNA de CreA de Humicola grisea, mas apresenta interações DNA-proteína específicas nas fases de micélio e levedura. Adicionalmente, resultados de RT-PCR em tempo real revelaram que o gene Pbfks1 é mais expresso em meio com acetato do que em meio com glicose como fonte de carbono. Portanto, o trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa fornece dados que podem contribuir para a compreensão da regulação dos promotores dos genes 1,3-b-glicana sintase e quitina sintase 4 em P. brasiliensis. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTParacoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), is a thermal dimorphic fungus which grows as a mycelium at room temperature and differentiates to yeast in cultures at 37°C and in the host tissue. The dimorphic transition of P. brasiliensis is associated with changes in the cell wall. When the fungus differentiates from mycelium to yeast, the chitin content is increased and the composition of glucan changes, reducing the 1,3-β-glucan content and enhancing the content of 1,3-α-glucan. In P. Brasiliensis, one homologous of 1,3-β-glucan synthase gene (Pbfks1) and six genes of chitin synthase (Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e Pbchs6) were identified. In our study, we investigated the promoter region of Pbfks1 and Pbchs4 genes. By means of Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), we analyzed probes referring to promoters of these two genes and we identified probable regulatory sites. The analysis of the promoter region of the Pbfks1 gene indicates one TATA Box that could be functional, and we propose that the Pbchs4 promoter may be regulated by the stress responsive elements (STRE). Furthermore, we also demonstrated that the PacC DNA binding-domain of P. brasiliensis recognizes one A. nidulans’s PacC described site, nevertheless, the protein didn’t recognize one variation in the consensus sequence in the Pbchs4 promoter. We observed one Pbchs4 promoter probe with one CreA transcription factor site doesn’t interact with the CreA DNA bind-domain of Humicola grisea, but shows specific DNA-protein interactions in mycelium and yeast phases. Additionally, results of Real Time RT-PCR disclosed that Pbfks1 gene is more expressed in medium with acetate then in medium with glucose as a carbon source. Therefore, the work developed in our research group provides data which may contribute for the comprehension of 1,3-β-glucan synthase and chitin synthase 4 promoters’ regulation in P. brasiliensis