Patogênese de Escherichia coli enteroagregativa : o papel de supostos pili F na intensificação de biofilmes mistos e na adesão a células HeLa

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009.Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é uma categoria diarreiogênica composta por isolados que expressam o característico padrão de adesão agregativa (AA) em associação com células epiteliais. Nas cepas protótipo de EAEC, o fenótipo AA está associado à presença dos plasmídios pAA que codificam para fímbrias de adesão agregativa (AAF). Não obstante, o padrão AA é um evento multifatorial influenciado pela expressão de adesinas afimbriais, de pili e de fimbriais não associadas aos plasmídios AA. Cepas de EAEC típicas (pAA+) são proficientes na formação de biofilmes, característica considerada fator de virulência consensual desta categoria. Durante um estudo epidemiológico, o isolado C. freundii (Cf) 205 demonstrando fenótipo AA foi isolado de uma criança diarréica juntamente com a cepa de EAEC 205-1. Em ensaios preliminares, foi mostrado que a adesão bacteriana a células epiteliais era intensificada em decorrência da co-infecção por Cf 205 e cepas de EAEC. Este estudo tem por objetivo determinar características de patogenicidade em cepas de C. freundii e definir os eventos biológicos mediadores da ação sinérgica de adesão descrita. Ensaios de adesão a células HeLa e de formação de biofilme, bem como a detecção de marcadores de virulência de E. coli, foram realizados para determinar possíveis associações entre cepas de C. freundii e diarréia. Todas as 28 cepas de C. freundii utilizadas no estudo foram negativas para os fatores de virulência pesquisados. Isolados de C. freundii recuperados exclusivamente de diarréia foram caracterizados pela expressão do padrão AA e pela formação de intenso biofilme, e, então, foram denominados C. freundii agregativo formadores de biofilme (BACF). Para determinar a natureza do efeito sinérgico desenvolvido por C. freundii e cepas de EAEC, ensaios de pré-condicionamento de meio de cultura foram conduzidos com o intuito de verificar a ocorrência eventos de sinalização química. Adicionalmente, análises de ultra-estrutura baseadas em microscopia eletrônica de varredura foram realizadas em complemento a ensaios de agregação bacteriana e de formação de biofilme para verificar o envolvimento de apêndices bacterianos na ação sinérgica descrita. A cepa de BACF 205 mostrou-se capaz de induzir agregação bacteriana quando na presença de cepas de EAEC. Os agregados bacterianos eram mediados por apêndices flexíveis expressos por cepas de EAEC que portavam genes para pilina F (traA). Estruturas semelhantes foram visualizadas nos biofilmes simples formados por cepas de EAEC traA-positivas, como também nos biofilmes mistos intensificados em decorrência da co-cultura de BACF 205 e cepas de EAEC traApositivas. O aumento dos biofilmes mistos produzidos pela combinação BACF 205-EAEC traA-positiva foi abolido por zinco, um inibidor específico de pili F. Complementarmente foi mostrado que zinco inibe seletivamente a maioria dos biofilmes formados por cepas de EAEC típicas isoladas de crianças diarréicas. Em conclusão, supostos pili F expressos por cepas típicas de EAEC incrementam a formação de biofilmes mistos quando na presença de BACF. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTEnteroaggregative Escherichia coli (EAEC) are enteropathogenic strains that display the distinctive aggregative adhesion (AA) when in association with cultured cells. In typical EAEC strains, the AA phenotype is associated with specific fimbriae (AAFs) encoded by plasmids (pAA). However, other factors, including afimbrial adhesins and pili, are also associated with this adherence pattern, indicating its complex nature. The expression of biofilms has been considered a consensual virulence factor among typical (pAA+) EAEC isolates. During an epidemiologic study focusing infantile diarrhea, AA-positive Citrobacter freundii (Cf) 205 and EAEC strains were concomitantly recovered from a severe case of mucous diarrhea. Preliminary assays showed that the coinfection of epithelial cells with Cf 205 and EAEC strains led to an increase in the bacterial adhesion. The aim of this study was to verify the occurrence of pathogenic traits in C. freundii strains as well as to identify the biological events underlying the increase in bacterial adherence. Biofilm and adhesion assays showed that C. freundii strains that displayed aggregative adhesion to HeLa cells and formed strong biofilms were exclusively isolated from diarrhea. This subset of strains was then named biofilm-forming aggregative C. freundii (BACF). All C. freundii strains were tested negative for the EAEC fimbrial genes as well as for others E. coli virulence markers. In attempt to define the nature of the synergic events developed by C. freundii and EAEC strains, pre-conditioned media were used to verify the role of chemical signals in the studied events. Additionally, bacterial aggregation and biofilm assays were carried out and ultrastructurally analyzed employing electron microscopy. The increased adherence was mediated by physical interactions among the bacteria and primed in the absence of chemical signaling. Thus, significant increases in bacterial adhesion were also observed during the formation of mixed biofilms on abiotic surfaces. Bacterial settling assays showed that EAEC strains harboring F-pili genes (traA) were capable of forming bacterial aggregates only in the presence of BACF. In scanning electronic microscopy analyses, it was observed that bacterial aggregates as well as enhanced biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC were mediated by non-bundle forming, flexible pili. Moreover, mixed biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC strains were significantly reduced using nonlethal concentration of zinc, a specific inhibitor of F pili. In addition, EAEC strains isolated from diarrheic children frequently produced single biofilms sensitive to zinc. In conclusion, putative F pili expressed by EAEC strains boosted the mixed biofilm formation when in presence of biofilm-forming aggregative C. freundii