Estudo voltamétrico da interação dos íons Zn2+, Cu2+, Cd2+ e Pb2+ com a enzima catalase

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2007.A catalase é uma enzima responsável pela redução de peróxido de hidrogênio (H O ) a água (H O) e oxigênio (O ), que apresenta alguns sítios de 2 2 2 2 ligação para íons metálicos (Cys, His). A ligação entre a enzima e os íons metálicos pode causar mudanças conformacionais ou estabilizar a estrutura da enzima, resultando na sua inibição ou ativação. A inibição da CAT, que ocorre com excesso de metal, contribui para o aumento da geração de espécies reativas de oxigênio, levando ao estresse oxidativo. Neste trabalho, foi estudado separadamente a 2+ 2+ 2+ 2+ interação dos íons metálicos Zn , Cu , Cd e Pb com a catalase, em meio semelhante ao fisiológico, por voltametria de redissolução anódica de pulso diferencial (DPASV), voltametria cíclica (CV) e voltametria de pulso diferencial (DPV). Os objetivos principais deste trabalho foram verificar a existência de interações entre os íons metálicos e a CAT, determinar os parâmetros quantitativos do sistema (estequiometria, constante de dissociação (K ) e potencial padrão de d 0´ redução do complexo (E )) e identificar por meio de estudo teórico os possíveis 2+ 2+ 2+ 2+ sítios de ligação dos íons Zn , Cu , Cd e Pb na estrutura da catalase, com o propósito de permitir uma melhor compreensão do papel dos metais no estresse 2+ 2+ 2+ 2+ oxidativo. Os possíveis sítios de ligação do Zn , Cu , Cd e Pb na molécula de CAT foram identificados, considerando apenas os sítios sem impedimento estérico contendo resíduos de histidina e cisteína, por meio de comparação dos parâmetros físico-químicos (MM, pI e MH) de peptídeos padrão que se ligam a zinco, cobre, cádmio e chumbo e dos peptídeos gerados na clivagem da CAT com as enzimas 2+ GluC2 e V8-proteinase. A formação de um complexo estável entre o Zn e a CAT foi -11 -1 verificada utilizando tanto a DPASV (K = 1,62 x 10 mol L ) quanto a CV (K = 2,98 d d -11 -1 2+ x 10 mol L ). Uma estequiometria de 20 íons Zn para uma molécula de CAT foi determinada para a reação, sendo este valor bem próximo do número de possíveis 2+ sítios de ligação do íon Zn identificados no estudo teórico (28 possíveis sítios de 2+ ligação). A formação de um complexo estável, com estequiometria de 16 íons Cu para uma molécula de CAT (valor bem próximo do número de possíveis sítios de 2+ identificados no estudo teórico - 24 possíveis sítios de ligação), ligação do íon Cu foi evidenciada pelo decaimento das correntes de oxidação/redução do metal com a -10 = 1,73 x 10 adição da CAT à solução e pelo valor da constante de dissociação (K d -1 -10 -1 -10 -1 mol L - DPASV, K = 1,25 x 10 mol L - CV, K = 1,81 x 10 mol L – DPV). A d d pequena diferença entre os valores teórico e experimental das estequiometrias dos complexos pode ser atribuída ao impedimento estérico de alguns sítios, considerados aptos nos estudos teóricos, ocasionada pelo tamanho da enzima e sua conformação na superfície do eletrodo e pelo pH do meio. Os valores de K d 2+ 2+ calculados para os complexos Zn – CAT e Cu – CAT sugerem a participação do zinco e do cobre na inibição da enzima catalase pela formação de complexos estáveis, contribuindo desta maneira para o estresse oxidativo. Para os sistemas 2+ 2+ Cd – CAT e Pb – CAT não foi possível determinar a estequiometria e a constante de dissociação, pois foi observado um decaimento pouco expressivo (a corrente não foi eliminada completamente) da corrente de oxidação do cádmio e do chumbo com a adição de CAT, levando às seguintes hipóteses: os sítios de ligação para esses metais já estão ocupados, há impedimento estérico para as ligações, a interação não é estável, ou a concentração dos metais no meio não favorece a formação dos complexos com a catalase. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACTCatalase (CAT), which is an important enzyme that catalyzes the decomposition of hydrogen peroxide (H O ) to water (H O) and oxygen (O ), contains 2 2 2 2 some metal binding sites (Cys, His). The binding of metal ions to CAT can change or stabilize its secondary structure, resulting in its inhibition or activation, respectively. The inhibition of CAT, which occurs when metal ions are in excess, contributes to the increase of the generation of reactive oxygen species, resulting in oxidative stress. In 2+ 2+ 2+ 2+ this work, the interaction of Zn , Cu , Cd and Pb ions with catalase was investigated, near physiological conditions, by using differential pulse anodic stripping voltammetry (DPASV), cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV). The developed methodology allows the direct determination of quantitative data (stoichiometry, dissociation constant (K ) and standard reduction d 0 2+ potential (E ’)) of metal ion-CAT systems and the theoretical identification of Zn , 2+ 2+ 2+ Cu , Cd e Pb binding sites. The acquired data will be useful to understand the 2+ 2+ 2+ role of metal ions in the oxidative stress mediated by catalase. Zn , Cu , Cd and 2+ Pb binding sites were identified in CAT, considering only the sites containing hystidine and cysteine residues without steric impediment, through comparison of physical-chemical parameters (MM, pI e MH) of standard peptides that bind zinc, copper, cadmium and lead ions and those from the peptides generated by the cleavage of CAT with GluC2 and V8-proteinase enzymes. The formation of a stable 2+ complex between zinc and catalase, with a stoichiometry of 20 Zn ions per one -11 -1 CAT, was attested by using DPASV (K = 1,62 x 10 mol L ) and CV (K = 2,98 x d d -11 -1 10 mol L ). The formation of a stable complex between copper and catalase, with a 2+ stoichiometry of 16 Cu ions per one CAT molecule, was attested by the decrease of oxidation/reduction currents of the metal with incremental additions of catalase and -10 -1 -10 by the dissociation constant (K = 1,73 x 10 mol L - DPASV, K = 1,25 x 10 mol d d -1 -10 -1 L - CV, K = 1,81 x 10 mol L – DPV). The small difference between theoretical d 2+ 2+ : 1 CAT; 24 Cu : 1CAT) and experimental stoichiometry values found for (28 Zn these complexes can be assigned to the steric impediment of some sites identified in the theoretical studies, caused by the size of the enzyme and its conformation on the 2+ electrode surface and by the pH of the medium. The calculated K values for Zn – d 2+ CAT and Cu – CAT complexes suggest the involvement of these two metal ions in the inhibition of catalase by the formation of a stable complex with the enzyme, 2+ 2+ – CAT and Pb – CAT contributing in this way to the oxidative stress. For Cd systems, it was not possible to determine the stoichiometry and dissociation constant, because it was observed a small decrease (the oxidation current was not completely eliminated) of the oxidation currents of cadmium and lead in the presence of CAT in the voltammograms, taking to the following hypotheses: the binding sites for these metals ions have already been occupied, there is a steric impediment for the bindings, the interactions are not stable, or the concentration of metal ions in solution does not allow the interactions with catalase