Análise proteômica comparativa entre neutrófilos não ativados e ativados com PMA, um análogo do diacilglicerol

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007.Os neutrófilos constituem o principal tipo de leucócito do sangue periférico e protegem contra infecções fúngicas e bacterianas. Devido à sua capacidade de quimiotaxia, conseguem chegar rapidamente a um sítio de infecção e destruir os patógenos invasores. Essas células podem existir em três estágios de ativação denominados, quiescente, estimulado e ativado. Neutrófilos ativados produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), aumentam sua capacidade fagocitária; têm a apoptose retardada além de outras funções. Os polimorfonucleares podem ser ativados in vitro por várias substâncias, dentre elas o PMA, que atravessa as membranas e ativa, diretamente, várias isoformas de PKC. Neste trabalho, os neutrófilos foram purificados a partir do sangue venoso periférico, e obtidos após centrifugação do sangue total em um gradiente de percoll (pureza maior que 96% e viabilidade maior que 97%). Em seguida, 107 células foram ativadas com PMA 100 ng/mL, por 30 minutos, mantendo também um grupo controle não ativado. Análises citométricas foram executadas para se acompanhar a ativação celular através da explosão respiratória e a viabilidade e pureza da separação dos neutrófilos. Também foi realizada uma análise comparativa dos géis bidimensionais na condição Normal e ativada com PMA, verificando que 12 spots tiveram sua expressão aumentada com a ativação e 62 apresentaram expressão diminuída nesta condição. Além disso, 141 spots foram considerados como pertencentes apenas ao gel Normal e 109 spots foram exclusivos da condição PMA. Trinta e cinco spots foram sujeitos à identificação por peptide mass fingerprinting, dos quais seis foram identificados. Entre as proteínas identificadas, quatro são relacionadas ao processo inflamatório e duas foram classificadas como estruturais. RBCK1 e CRAa, foram encontradas pela primeira vez em neutrófilos. Nossa hipótese é que MEK1 e MEKK1, reduzam a atividade transcricional de RBCK1, enquanto PKA aumenta sua atividade. A lisozima, proteína microbicida de grânulos específicos e a ?-actina, classificada como a principal isoforma do citoesqueleto de neutrófilos, também foram identificadas. MRP-14, presente no citoplasma de neutrófilos, apresenta efeitos bacteriostáticos e semelhantes às citocinas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTNeutrophils are the major type of leukocytes in peripheral blood and protect against fungal and bacterial infections. Directed migration in a gradient of chemotactic stimuli enables these cells to rapidly find the site of infection and destroy the invading pathogens. PMNs can exist in three different activation states, namely, resting, primed, and activated states. Activated neutrophils produce reactive oxygen species (ROS), in what is known as respiratory burst, increase phagocytosis, delay apoptosis, among other functions. These cells can also be activated in vitro by particles and substances such as phorbol-myrystate-acetate (PMA). The PMA is a diacylglicerol (DAG) analog that bypasses membrane receptors and directly activates intracellular protein kinase C isoforms (PKC). In this study, human neutrophils were prepared from peripheral venous blood of healthy volunteers (greater than 96% purity, greater than 97% viability) and were obtained by density centrifugation on percoll gradient. 107 cells were activated with 100ng PMA for 30 minutes in 1 mL of PBS. Cytometric analysis was executed for measurement of respiratory burst, viability and purity from neutrophils. A comparative analysis of 2D-eletrophoresis gels, of normal and PMA activated neutrophils was executed, and 83 spots revealed differential expression, from which 13 spots were up regulated after PMA activation and 70 were down regulated in this condition (p≤0,05). Moreover, 141 spots were regarded as belonging only to normal gel, and 109 spots were exclusive of the PMA activated neutrophil map Thirty five conserved spots were subjected to peptide mass fingerprinting, yielding six identifications. Among the identified proteins, four are related to the inflammatory process and two are classified as structural. RBCK1 and CRAa, were found for first time in neutrophils. Our hypothesis is that MEK1 and MEK kinase 1 (MEKK1) represses the RBCK1 activity, and PKA enhances its activity. Lysozyme, a microbicidal protein of specific granules, and β-actin, the main isoform of neutrophil cytoskeleton were identified too. MRP-14, present in the neutrophil cytoplasm, provides bacteriostatic and cytokine-like effects