Utilização do promotor do gene PGK1 de Pichia pastoris para expressão heteróloga

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008.A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para a expressão de várias proteínas heterólogas sendo que diversos vetores já foram desenvolvidos para este sistema. Os principais vetores de expressão de P. pastoris são baseados no promotor do gene AOX1 que codifica a enzima álcool oxidase 1. Alguns estudos têm sido realizados para o uso de promotores alternativos uma vez que o sistema AOX1 apresenta algumas desvantagens. Em nosso laboratório foi isolado e caracterizado o promotor do gene PGK1 de P. pastoris (PPGK1), um promotor forte e constitutivo, que representa uma alternativa promissora para a construção de novos vetores. O objetivo deste estudo foi determinar a região promotora mínima do PPGK1 por meio de deleções controladas utilizando o gene da α-amilase de Bacillus subtilis como gene repórter. Quatro deleções foram obtidas sendo que a menor (PPGKΔ3), com ~400 pb, ainda manteve atividade promotora. Foi demonstrado que esta seqüência é capaz de dirigir a integração de um vetor no genoma de P. pastoris e 51% dos clones transformantes tiveram mais de uma cópia integrada. O uso deste promotor propiciou a expressão heteróloga de α-amilase em altos níveis (250 U.mL-1). Também foram construídos vetores para expressão intracelular baseados no promotor PGK que, todavia, ainda necessitam ser aprimorados para uso em P. pastoris. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe methylotrophic yeast Pichia pastoris has been successfully used for the expression of heterologous proteins and several different expression vectors have been developed for this system. The main expression vectors for P. pastoris are based on the alcohol oxidase 1 gene promoter, AOX1. Some studies have been carried out aiming at the use of alternative promoters once the AOX1 system shows some disadvantages. Our laboratory has isolated and characterized the P. pastoris promoter from the PGK1 gene (PPGK1), a strong and constitutive promoter, which represents a promising alternative for the construction of new vectors. The aim of this study was to determine the minimal promoter sequences from PPGK1 through controlled deletions using the α-amylase gene from Bacillus subtilis as a reporter gene. Four deletions were obtained and the smallest (PPGK Δ3) with ~ 400 bp, still maintained promoter activity. We have demonstrated that this sequence was able to direct vector integration into the P. pastoris genome and 51% of the transformants showed more than one copy integrated. The use of this promoter allowed high level expression of α-amylase (250 UmL-1). Also, vectors for intracellular expression were based on the PGK promoter were also constructed which however still need to be improved for use in P. pastoris