História evolutiva de um retrotransposon-LTR nos dois genomas componentes do amendoim

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007.O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) é uma cultura de grande importância econômica, sendo cultivado em vários países do mundo. As safras na agricultura são reduzidas por estresses bióticos e abióticos aos quais as espécies silvestres são resistentes. Visando a obtenção de plantas mais resistentes, foi desenvolvida uma estratégia onde as espécies silvestres seriam as doadoras de genes de resistência que seriam transferidos através de cruzamentos interespecíficos. O primeiro passo seria a construção de mapas genéticos que identifiquem as distâncias e as posições dos genes de interesse no genoma de cada espécie. O segundo passo seria a correção da diferença de ploidia entre as espécies, já que a cultivada é uma alotetraplóide (2n=4x=40) com genoma AABB e as silvestres diplóides (2n=2x=20) com genomas AA ou BB. Porém, problemas de incompatibilidade entre os cruzamentos são comuns. Isso se deve muitas vezes por causa de diferenças nas composições das regiões não-codantes e de repetições, o que faz necessário um estudo detalhado dessas regiões. Dentre as seqüências repetitivas de maior importância estão os retrotransposons, elementos que se multiplicam no genoma e inserem uma nova fita de DNA em diferentes sítios. Neste trabalho, foram isoladas e caracterizadas seqüências de um retrotransposon LTR do amendoim cultivado e de seus parentais silvestres (A. duranensis e A. ipaënsis). A seqüência codificadora da enzima transcriptase reversa foi amplificada através de PCR utilizando combinações de iniciadores específicos. O Southern blot não mostrou nenhum sinal de metilação na seqüência desse elemento, mas através de sondagem de 20 mil seqüências de ESTs nenhuma similaridade foi encontrada, sugerindo que esse elemento não é expresso. Análises filogenéticas e estatísticas foram realizadas utilizando-se 87 contigs, onde seqüências nucleotídicas e de aminoácidos formaram grupos específicos nas árvores de similaridade, indicando que o retrotransposon evoluiu diferentemente nos genomas das espécies parentais. De acordo com o cálculo do número de substituições sinônimas na seqüência desse elemento, observou-se que ele é mais variável no genoma BB. Já no genoma AA de A. duranensis ele parece ter sofrido modificações recentes, provavelmente decorridas da transposição desse elemento há cerca de 2-6 milhões de anos, fato que não pode ser observado no genoma de A. ipaënsis. O número de cópias calculado por genoma diplóide nas três espécies foi, em média, 800 em A. ipaënsis, 3 mil em A. duranensis e 5 mil em A. hypogaea. Esses resultados mostram que o retrotransposon é muito antigo e provavelmente fazia parte do genoma do ancestral comum à diferentes grupos vegetais. Após a diferenciação nas espécies parentais o retrotransposon provavelmente multiplicou seu número de cópias no genoma AA e permaneceu praticamente inalterado no genoma BB. Apesar de ser encontrado em regiões eucromáticas e de não estar metilado ele se mantém inativo. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe cultivated peanut (Arachis hypogaea) is a crop of economic importance and it is cultivated in several countries around the world. Yields in agriculture are reduced by biotic and abiotic stresses to which most the wild species are resistant. With the aim of developing more resistant plants, a strategy of crossing where wild species are the donors of resistance genes to the cultivated peanut is used. The first step is to develop a linkage map to identify the distances and positions of genes of interest for each species. The second step is the correction of the number of chromosomes since the cultivated peanut is an allotetraploid (2n=4x=40) with an AABB genome and the wild species are diploid (2n=2x=20) with AA or BB genomes. However, problems of incompatibility during crosses are common. One possible cause for incompatibility is the difference in the intergenic noncoding regions of different species. For this and other reasons, the study of repetitive DNA is interesting. Among the repetitive sequences, retrotransposable elements are found to be of major importance because they can copy of themselves into new chromosome sites. In this work we reported the isolation and characterization of an LTR retrotransposon from the cultivated peanut and its wild parental genomes (A. duranensis and A. ipaënsis). The coding region of the reverse trancriptase gene was amplified by PCR using specific primer combinations derived from genomic sequences of the Arachis data base. No methylation was found using Southern blot but also no significant homology to 20.000 ESTs sequences on the GenBank, suggesting that this element is not expressed. Phylogenetic and statistical analyses were done with 87 contigs. Both the nucleotide and aminoacid sequences formed specific groups indicating that the retroelement evolved differently in the wild species genomes. According to the synonymous substitutions content it was observed that the retrotransposon has accumulated more mutations in BB genome than in the A. duranensis genome, probably because of a recent amplification that occurred about 2-6 myr ago. The copy number calculated per diploid genome for the three species was aproximately: 800 for A. ipaënsis, 3.000 for A. duranensis and 5.000 for A. hypogaea. These results show that the element is ancient and it was a part of the genome of a species ancestral to many different groups of plants. After the differentiation between the two parental species, this element probably multiplied its copy number in the AA genome and remained almost silent in the BB genome. Although the element is dispersed in euchromatic regions and does not present any methylation no sign of activity was found