Baculovírus recombinantes contendo genes de proteases são mais virulentos contra Spodoptera frugiperda

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006.Os baculovírus são vírus de DNA, específicos de artrópodes, possuindo uma ampla utilização, principalmente, como bioinseticida em lepidópteros e como vetores de expressão de genes heterólogos. A habilidade do vírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) de infectar um grande número de hospedeiros tem facilitado estudos moleculares desse vírus com o objetivo de melhorar sua propriedade bioinseticida. Este trabalho teve por objetivo a construção de AcMNPV recombinantes com a introdução de um gene de uma protease (catepsina-L) e de uma quitinase no genoma viral, para a observação dos efeitos da infecção viral em larvas de Spodoptera frugiperda, comparativamente aos vírus AcMNPV selvagem e outro AcMNPV recombinante, contendo o gene de uma serino-protease (queratinase) de Aspergillus fumigatus. Outro objetivo do trabalho foi a construção de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) recombinantes com a introdução dos genes das proteases catepsina-L e queratinase no genoma viral. Foram utilizados os vetores de transferência pSynXIVVI+X3 e p2100, respectivamente, para cada vírus. O DNA plasmidial dos vetores de transferência recombinantes foi co-transfectado com o DNA do vírus vSyngalVI- e do vAgGalA2, em células de Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) e Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286), respectivamente. Os isolamentos dos vírus recombinantes foram feitos com a técnica de diluição seriada em placa de 96 poços e a detecção dos vírus recombinantes se deu pela observação de poliedros nas células infectadas por meio da microscopia de luz. O vírus AcMNPV recombinante contendo o gene da catepsina-L (vSynCAT) assim como o AcMNPV recombinante contendo o gene da queratinase (vSynQUERAT) foram mais virulentos contra larvas de 3° e 4° instar de S. frugiperda quando comparados aos vírus selvagem e o vírus AcMNPV xx recombinante contendo o gene da quitinase (vSynQUIT). Além disso, os vírus vSynCAT e vSynQUERAT induziram a melanização da cutícula dos insetos nos estágios mais tardios da infecção. Os AgMNPV recombinantes ainda não foram isolados e, desta forma, não foi possível analisar o efeito desses genes no genoma do baculovírus mais utilizado como bioinseticida no mundo. __________________________________________________________________________________ ABSTRACTBaculoviruses are DNA viruses specific to artropods. They have been widely used as bioinseticides against lepidopterous insect pests and as heterologous gene expression vectors. The ability of the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) to infect a great variety of hosts, have facilitated molecular biology studies aiming the improvement of this virus as a biopesticide. The aim of this work is the construction of recombinant AcMNPV viruses with the introduction of a protease gene (cathepsin-L) from Sarcophaga peregrina and a chitinase gene from Metarhizium anisopliae, into the viral genome and observation of the effects of these recombinant viruses during the infection of Spodoptera frugiperda larvae, comparatively with the wild-type AcMNPV and another AcMNPV recombinant, containing a serino-protease (keratinase) gene from Aspergillus fumigatus . Another aim of this work was the construction of Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) recombinant viruses containing the cathepsin-L and keratinase genes into the viral genome. The pSynXIVVI+X3 e p2100 transfer vectors were used, respectively for each virus. Recombinant transfer vectors DNAs were co- transfected with DNA from polyhedrin minus vSyngalVI- and vAgGalA2 viruses, in Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) and Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286) cells, respectively. Isolation of the recombinant viruses was carried out using the serial dilution method in 96 well-plates and was achieved by the observation of polyhedra inside infected cells under a light microscope. The AcMNPV recombinant containing the cathepsin-L gene (vSynCAT), as well as the AcMNPV recombinant containing the keratinase gene (vSynQUERAT), were more virulent towards 3° and 4° instar S. frugiperda larvae, when compared to the wild-type AcMNPV and a AcMNPV xxii recombinant containing the kitinase gene (vSynQUIT). Furthermore, the vSynCAT and vSynQUERAT viruses induced melanization of insect cuticule late in infection. The AgMNPV recombinants have not been isolated yet, and therefore, it was not possible to analyse the effect of the introduction of these genes on the virulence of the world most used baculovirus biopesticide