Caracterização molecular de mutantes gerados pela passagem serial do baculovírus Anticarsia gemmatalis MNPV em cultura de células

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008.Baculovírus são vírus de inseto com grande potencial de uso em programas de controle biológico principalmente devido ao seu apelo ecológico, uma vez que são altamente específicos ao inseto alvo e não apresentam toxicidade ao homem e ao meio ambiente. Sua produção tem sido feita basicamente pela sua multiplicação no inseto hospedeiro. Porém, a produção de baculovírus em cultivos celulares oferece vantagens em relação à multiplicação in vivo por ser um sistema controlável, estéril, com alta pureza do produto e por dispor de centenas de linhagens de células de inseto estabelecidas. No entanto, sucessivas passagens do vírus em cultura de células podem resultar em alterações genéticas levando à perda de virulência. A alteração mais comum refere-se à formação de mutantes FP (Few Polyhedra) devido a mutações no gene 25k fp. O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) vem sendo utilizado com sucesso como agente de controle da lagarta da soja (A. gemmatalis). Entretanto, sua produção tem sido feita in vivo e pouco se conhece sobre sua produção em cultivos celulares. Nesse trabalho, os efeitos causados pela passagem do vírus AgMNPV em células BTI-Tn-5B1-4 foram estudados. A porcentagem de células contendo muitos poliedros manteve-se alta e constante até a quinta passagem. A partir desse ponto houve uma redução significante na quantidade de células com muitos poliedros com concomitante aumento na quantidade de células com poucos poliedros. Em paralelo, houve um dramático aumento no título viral pela produção de vírus extracelulares (budded virus). Todos esses parâmetros associados à análise ultraestrutural caracterizam a geração de mutantes FP durante a passagem serial do vírus em cultura de células. Adicionalmente, os perfis de restrição do DNA viral obtido em diferentes passagens mostraram similaridade revelando a ausência de grandes modificações genéticas, como deleções e inserções no genoma do vírus. A indicação da presença de alterações menores como mutações pontuais no locus do gene 25k fp foi comprovada pela determinação da sequência nucleotídica deste gene nos mutantes selecionados (sobrenadante da sétima passagem). Mutações pontuais foram detectadas em três clones (FP1, FP3, FP4) na região do gene 25k fp, incluindo sua região promotora, sendo que apenas um clone (FP5) não apresentou qualquer alteração nesse gene. Com base na cinética de síntese de proteínas utilizado marcação radioativa, uma redução na síntese da poliedrina (principal componente protéico dos corpos de oclusão) foi também observada em todos os clones do tipo FP em comparação com o vírus padrão. Além disso, a análise ultraestutrural dos clones FP revelou características típicas de formação de mutantes FP como células com poucos ou nenhum poliedro, produção de poliedros amorfos com baixo número de virions e formação de estroma virogênico com intensa produção de nucleocapsídeos. Finalmente, variantes Many Polyhedra (MP), apresentando um maior número de poliedros por célula e um título de budded virus similar ao vírus parental, foram selecionados como parte de uma estratégia para produção do vírus em escala maior em cultivos celulares (biorreatores). _________________________________________________________________________________________ ABSTRACTBaculovirus are insect viruses with great application potential for biological control programs due mainly to their ecological appeal, once they are highly specific to the host insect and do not present toxicity to man and to the environment. Their production has been made basically by their multiplication in host insects. Nevertheless, baculovirus production in cell cultures offers advantages over the in vivo multiplication for being a controllable, sterile, high pureness product yield process besides the fact of hundreds of cell lines being already established. However, successive passages of the virus in cell culture result in genetic alterations leading to loss of virulence. The most common alteration is the FP (Few Polyhedra) mutants formation due to mutations in the 25k fp gene. Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) baculovirus is being used successfully as control agent of the soybean caterpillar (A. gemmatalis). However, its production has been made in vivo and little is known on its production in cell cultures. In this work, the effects caused by the passage of the AgMNPV in BTI-Tn-5B1-4 cells was studied. The percentage of cells containing many polyhedra remained high and constant until the fifth passage. From this point on there was a significant reduction in the amount of cells with many polyhedra with concomitant increase in the amount of cells with few polyhedra. In parallel, there was a dramatic increase in the viral titer by production of extracellular virus (budded virus). All these parameters associated to the ultra structural analysis characterize the FP mutants generation during serial passage of the virus on cell culture. Additionally, there was similarity in the viral DNA restriction endonuclease digestion profile of different passages reveling no significant genetic modifications, such as deletions and insertions. The indication that small alterations, such as point mutations, present in the 25k fp gene locus was confirmed by this gene nucleic sequence determination in the selected mutants (seventh passage of supernatant). Point mutations in the 25k fp gene region were detected in three clones (FP1, FP3 and FP4), including its promoter region, and only one clone (FP5) did not present any alteration in this gene. Based on the protein synthesis kinetics using radioactive labeling, a reduction in the polhyedrin synthesis (the main component of the occlusion bodies) in all FP clones was also observed in comparison to the standard virus. Moreover, the ultra structural analysis of the FP clones disclosed typical characteristics of FP mutants formation such as cells with few or no polyhedra, amorphous polyhedra production with low virions number and virogenic stroma formation with intense nucleocapsid production. Finally, Many Polyhedra (MP) variants, presenting a larger number of polyhedra per cell and a similar to the parental virus budded virus titer, were selected as part of a strategy for a larger viral scale up production in cell culture (bioreactors)